多抗噬菌體菌株大腸桿菌E.coli PRE12在LB培養基和TB培養基下的生長曲線圖
噬菌體是一類侵染細菌、放線菌等微生物的病毒，它們數量多、體積小、繁殖快、基因組可塑性高，是病毒中最為普遍和分布最廣的群體。噬菌體污染具有多樣性和頑固性特點，生物發酵類企業一旦出現噬菌體污染現象，若不及時處理，就會迅速擴散，甚至反復污染，造成不可估量的損失。
面對自然界存量遠大于自己的噬菌體，細菌進化過程中，為了適應這種長期的生存壓力，協同進化具備了多種防御噬菌體侵染的機制，于噬菌體侵染過程的不同階段起作用，比如CRISPR系統、限制修飾(R-M)系統等(Tock Mark R,Dryden David T F,Thebiology ofrestriction and anti-restriction.[J].Curr Opin Microbiol,2005,8:466-72)。目前，工業上通過馴化篩選抗噬菌體菌株，因操作簡單，效果顯著而被廣泛使用。但是目前各實驗室和生產企業研究抗噬菌體大腸桿菌會有意識的進行時空分割，或者針對一種噬菌體的侵染進行研究，獲得抵抗單一噬菌體的大腸桿菌，或者針對不同噬菌體的分別侵染進行研究，獲得抵抗廣譜噬菌體的大腸桿菌，而環境中噬菌體種類繁雜，同一時段、同一空間感染噬菌體往往并非單一類型，而是多種噬菌體共同爆發，這一污染現象我們可以稱之為噬菌體群體爆發，而這些單一譜系和廣譜的抗噬菌體大腸桿菌面對這種實際發酵生產場景中經常遇到的噬菌體群體爆發，效果甚微。
圖為大腸桿菌E.coli PRE12(方形)和E.coli BL21(DE3)(圓形)在LB培養基和TB培養基下的生長曲線圖；
實施：
多抗噬菌體菌株E.coli PRE12的抗噬菌體群體侵染能力和生長能力分析。
1.多抗噬菌體菌株E.coli PRE12的抗噬菌體性能分析。
(1)為了檢測多抗噬菌體菌株大腸桿菌E.coli PRE12在噬菌體污染環境中的實際應用價值，進行抗噬菌體性能檢測。具體步驟如下：挑取E.coli PRE12和E.coli BL21(DE3)單克隆，接種LB液體培養基(50mL/250mL錐形瓶)，37℃，200rpm培養12h，分別取約1×109
個細胞加入5mL半固體LB培養基混勻，平鋪在LB固體平板上層。室溫放置5-10min，待凝固后，平板等分3個區域，分別滴加5μL稀釋梯度為100、10-2、10-4的噬菌體樣(6組噬菌體樣，編號P01-P06，來源于污染噬菌體的生產車間和實驗室，經NGS測序鑒定，每批爆發噬菌體污染的噬菌體種類眾多且不同，其噬菌體類型涵蓋I：dsDNA噬菌體；II：ssDNA噬菌體，起始噬菌體滴度約為108pfu/mL)，做好標記，37℃培養12-24h，觀察噬菌斑出現情況。
(2)結果如圖8所示，相比較于E.coli PRE12平板的噬菌斑形成情況，不同組噬菌體樣更容易在E.coli BL21(DE3)平板上形成噬菌斑，表明E.coli PRE12菌株面對廣譜的復雜噬菌體環境，其抵抗噬菌體群體侵染能力增加了102-106倍，明顯優于E.coli BL21(DE3)，在噬菌體污染環境中具備潛在的實際應用價值。
2.多抗噬菌體菌株E.coli PRE12、大腸桿菌E.coli BL21(DE3)和ER2566(唯地生物，貨號：EC1060)的抗噬菌體性能檢測。
(1)市場上可以獲得的具備噬菌體抗性的大腸桿菌表達宿主較少，ER2566具備T1噬菌體抗性，且被用于表達重組蛋白。為分析這三種表達宿主的抗噬菌體性能進行噬菌斑檢測，方法同前，使用噬菌體樣為生產過程中爆發的噬菌體樣，編號P07和P08。經NGS測序鑒定，兩組樣品的噬菌體種類眾多且不同，其噬菌體類型涵蓋I：dsDNA噬菌體；II：ssDNA噬菌體，起始噬菌體滴度約為108pfu/mL。
(2)結果如圖9所示，多抗噬菌體菌株E.coli PRE12具備顯著優于E.coli BL21(DE3)和ER2566的抗噬菌體性能和應用潛力。
3.多抗噬菌體菌株E.coli PRE12生長曲線測定。
(1)測定E.coli BL21(DE3)和E.coli PRE12的生長曲線。具體步驟如下：將E.coliBL21(DE3)和E.coli PRE12分別接種于3mL LB新鮮培養基中，37℃，200rpm培養12h。次日分別取500μL于50mLLB培養基中(250mL錐形瓶)，37℃，200rpm培養12h。培養至第0h、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h時分別取樣1mL，使用紫外分光光度計測定OD600。
(2)結果如圖10所示，E.coli BL21(DE3)(圓形)和E.coli PRE12(方形)的細胞生長能力無明顯差異。
4.多抗噬菌體菌株E.coli PRE12蛋白表達水平測定，具體步驟如下：
(1)重組蛋白表達質粒制備
為獲得EGFP蛋白表達質粒，分別使用引物P01-F/P01-R擴增SEQ ID NO.7所示的DNA序列和引物P-VF/P-VR擴增pET-28a(+)獲得線性化載體，使用上述一步克隆試劑盒將EGFP片段插入到pET-28a(+)中，得到pET-28a-EGFP重組蛋白表達質粒，引物見表格1。
(2)重組蛋白表達菌株構建
將EGFP蛋白表達質粒pET-28a-EGFP(目的蛋白攜帶His標簽，29.2kDa)分別轉化E.coli BL21(DE3)、E.coli PRE12和ER2566，獲得EGFP的不同宿主的蛋白表達菌株。
(3)重組菌株誘導蛋白表達
挑取攜帶EGFP表達質粒的E.coli BL21(DE3)、E.coli PRE12和ER2566重組菌株單克隆分別接種3mL液體LB培養基(50μg/mL kan)，37℃，200rpm培養12h。取500μL一級種子液，轉接50mL液體LB培養基(250mL錐形瓶)，37℃，200rpm培養10-14h。次日，取5mL二級種子液，轉接500mL TB培養基(3L錐形瓶)，37℃，200rpm培養至OD600
＝1.2時，降溫至25℃，使用終濃度0.5mM IPTG誘導表達12h。離心收集菌體，稱取濕菌1g，使用PBS緩沖液，1：20破菌(1g濕菌對應20mL PBS)，離心收集上清，沉淀使用20mL PBS重懸，分別制備40μL上清+10μL 5×上樣緩沖液和40μL重懸沉淀+10μL 5×上樣緩沖液兩個樣品，煮沸5min，進行SDS-PAGE電泳檢測。結果如圖11所示，E.coli PRE12的重組蛋白表達性能總體等同或優于E.coli BL21(DE3)和ER2566。
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