基于可培養技術的古象牙病害微生物分離鑒定與抑菌劑篩選評價（一）
摘要
為科學有效防控三星堆出土古象牙的微生物病害，采用可培養技術對三星堆出土古象牙殘片表面滋生的細菌和真菌進行分離鑒定，并測定苯扎氯銨、苯并咪唑、制霉菌素、三氯生、特泯菌5種抑菌劑對微生物的最小抑菌濃度(MIC)，分析抑菌效果，確定科學的使用劑量。通過可培養方法從三星堆古象牙殘片上分離出4株分屬于4個屬的細菌，分離出29株分屬于3個門16個屬的真菌，其中子囊菌門(Ascomycota)7個屬、擔子菌門(Basidiomycotina)7個屬以及半知菌門(Deuteromycetes)2個屬。抑菌結果表明，除苯并咪唑外，其他4種抑菌劑的抑菌濃度雖然存在差異，但在一定濃度范圍內都能達到完全抑菌的效果。苯扎氯銨、三氯生、特泯菌能夠抑制所有細菌生長的MIC分別為64、256、8 mg/L，在復配處理中，3種抑菌劑苯扎氯銨(MIC 16 mg/L)、三氯生(MIC 64 mg/L)、特泯菌(MIC 2 mg/L)兩兩隨機復配均能達到完全抑菌效果；苯扎氯銨、三氯生、制霉菌素能夠抑制所有真菌生長的MIC分別為8000、400、400 mg/L，在復配處理中，制霉菌素與苯扎氯銨MIC分別為200、4000 mg/L時復配能完全抑制所有供試真菌的生長。可見，三星堆出土古象牙表面分布著種類豐富的微生物，不同抑菌劑對不同種類微生物的抑制效果存在差異，復配抑菌劑的抑菌效果優于單一菌劑；結果可為三星堆出土古象牙微生物病害防治和古象牙保護工作提供科學依據。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1樣品采集
三星堆古象牙殘片出土后被保存在墊有網狀海綿的塑料盒子中保藏，以出土于K5坑表面滋生有微生物的古象牙殘片樣品為研究對象，采用無菌棉簽對古象牙殘片已長菌或出現明顯色變的位置進行擦拭，并放置于無菌Eppendorf管中，保存于冰盒，立刻帶回實驗室進行后續研究。
1.1.2培養基及主要試劑與儀器
?培養基:PDA(potato dextrose agar)、TSA(tryptone soy agar)、MHA(Mueller-Hinton agar)，青島高科技工業園海博生物技術有限公司。
?主要試劑:真菌基因組DNA快速抽提試劑盒、PCR引物、瓊脂糖、制霉菌素、苯并咪唑、三氯生、特泯菌，生工生物工程(上海)股份有限公司；PCR mix,天根生化科技(北京)有限公司；核酸染料Redgeld,BBI生命科學有限公司；無水乙醇，成都市科隆化學品有限公司；苯扎氯銨，成都貝斯特試劑有限公司。
?主要儀器:超景深顯微鏡VHX7000，日本基恩士KEYENCE公司；光學顯微鏡，ZEISS公司；冷凍離心機，Eppendorf公司；PCR儀、瓊脂糖凝膠電泳儀、凝膠成像儀，Bio-Rad公司；DKT200-4恒溫金屬浴，杭州米歐儀器有限公司；恒溫培養箱，鄭州生元儀器有限公司；96孔細胞培養板，BBI生命科學有限公司；oCelloScope 微生物生長曲線測量儀，丹麥Biosense公司。
1.2方法
1.2.1古象牙殘片表面微生物觀察
將裝古象牙殘片的塑料盒子直接放于超景深顯微鏡載物臺上，于30x和200x的放大倍數下觀察古象牙殘片表面微生物形態并拍攝照片。
1.2.2菌株培養與純化
分別采用TSA和PDA培養基分離古象牙表面滋生的細菌和真菌，將采集的樣品在分離培養基上均勻涂布，每組重復3次。涂布后的PDA平板置于25°C恒溫培養箱培養3-5 d，TSA平板置于28°C恒溫培養箱培養2-3 d。待菌落長出后，挑取具有不同菌落特征的菌株進行純化，并用斜面試管和甘油管進行菌種保藏。
1.2.3菌株形態觀察及系統發育分析
?菌株形態學觀察:將分離獲得的細菌接種于TSA平板上28°C恒溫培養24 h，挑取單菌落進行革蘭氏染色，在光學顯微鏡下觀察菌株的顯微形態；將真菌接種于鋪有無菌玻璃紙(3 cm x 3 cm)的PDA平板上，25°C恒溫培養5 d，觀察菌落的顏色、大小、菌絲生長狀況，并用剪刀剪取長有菌的一小塊玻璃紙邊緣在50%的乙醇中漂洗5 s后將有菌面朝上置于載玻片上，滴加棉蘭染色液后蓋上蓋玻片，在光學顯微鏡下觀察菌絲以及孢子形態。
?DNA提取及系統發育分析:采用Cui等的方法提取細菌的DNA，采用30μL反應體系，以16S rRNA的通用引物8-27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAAC GAACGCT-3')和1492-1523R(5'-TACGG CTACCTTGTT-ACGACTT CATCACCC-3')對DNA進行PCR擴增。將長滿真菌菌絲的3 cm x 3 cm玻璃紙取出放置于2 mL的Eppendorf管中，用液氮快速冷凍研磨粉碎，用真菌基因組DNA快速抽提試劑盒按照說明操作提取真菌DNA。采用30μL反應體系，以ITS的引物ITS1F(5'-TCCGTAGGTGAACCTG CGG-3')和ITS4R(5'-TCCTCCG CTTATTGATATGC-3')對DNA進行PCR擴增。
PCR擴增產物送至杭州有康生物科技有限公司成都分公司進行測序，測序結果在NCBI中利用BLAST進行比對，找出與目標菌株同源性較高的16S rRNA/ITS序列，用MEGA7.0軟件通過鄰近法構建目標菌株的系統發育樹，確定其分類地位。
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