微生物生長監測系統應用：釀酒酵母II號染色體合成及生長曲線圖分析
酵母是與人類生活關系最密切的一類單細胞真核微生物，在啤酒、面包的制作中不可或缺。自然界分布有超過1500種酵母，其中釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是最早被廣泛用于食品發酵、疫苗生產等現代工業的酵母菌，是名副其實的“細胞工廠”；同時因為其清晰的遺傳背景，成為科學研究最常用的模式生物之一。早在1996年，完成了釀酒酵母全基因組測序，并發現酵母基因組總共約6000個基因中有5000個不是維持生命活動所必需的，可以進行刪減和改寫。隨著合成DNA技術的快速發展，大尺度重編基因組與人工合成成為可能。近幾年，科學家通過非生命的化學物質組裝成染色體，研究導致細胞死亡、細胞失活、生長缺陷的各項關鍵要素，探索生命本質。2010年，Gibson等人合成了首個原核生命體（生殖道支原體，Mycoplasma mycoides），而更復雜的真核基因組的序列設計與合成，已成為國際上合成基因組領域亟待突破的技術瓶頸。為此，研究團隊人工設計并再造了釀酒酵母II號染色體，并深入解析了合成染色體生物學功能。
實驗步驟
BY4741、BY4742和synⅡ三種酵母菌加入培養基中進行培養，Biosense微生物動態監測系統測量各類細菌的OD值以便獲取其生長曲線圖，培養過程中搖晃15秒后然后隔20分鐘測試一個OD（600nm）從而獲得幾種酵母菌的生長曲線圖。
實驗結果
本論文主要就酵母的染色體synⅡ進行研究。快速發展的DNA合成技術已經成為一種可以在基因組規模上進行重組的“構建-tounderstand”方法。本論文的研究中實現了對770-千堿基合成酵母染色體II(synII)的完成，并發現SynII的特點是具有廣泛的跨組學，盡管SynII結構發生了相當大的變化，但synII與野生型幾乎沒有區別，并且通過恢復轉移RNA(tRNA)基因拷貝數，可以觀察到對轉譯機制的上調。
圖1、synII和BY4741的細胞周期對比顯示的百分比。帶有分離的CEN2-GFP點、中期紡錘波和后期紡錘波的細胞。(B)復制配置synII(紅色)和BY4741(black)通過深度基因測序顯示的相對拷貝數。(C)RNA序列分析表明，synII中轉譯機械的顯著上調是由synII中tRNA基因的缺失引起的。
圖2、synII染色體的表型分析。圖A表示的是synII在不同介質上的表型測試。圖B表示的是synIIA-R,synIIR-Y的生長曲線圖以及synII菌株與BY4741和BY4742菌株生長曲線對比圖。圖C表示的是synII與BY4741菌株的細胞周期比較圖。圖像顯示了細胞在不同階段的細胞形態。圖D顯示synII細胞與分離的CEN2-GFP點(中期)的百分比。在細胞周期中紡錘波和后期紡錘波。每一個時間點至少計算了200個細胞，表示的是synII和BY4741菌株中期到后期細胞的總比。圖D表示的是SynII(紅色)和BY4741(black)復制時間表示，所得的數據通過深度測序的相對拷貝數計算。
圖3、synll染色體貫穿組學剖面分析（BY4741作為對比參照物）設計對細胞生理學的影響很小，只表現為適度的上調。其中trna采用的是去除觸發的轉譯機制(A到D)。如圖顯示，圖A表示的是synII細胞的轉錄組水平、(B)synII細胞的蛋白組水平、(C和D)synII細胞的代謝組與BY4741細胞對比。在轉錄組、蛋白質組和代謝組中，差異表達的總數量(P<0.001)也呈現出來，圖中對應上調和下調的特征分別用紅色和綠色標注。圖(E)表示的是通過轉錄組和蛋白質組在酵母菌中表達的富集途徑和表達剖面圖，上調的特征用紅色標注，下調的特征用綠色標注。圖(F)表示的對synII的RNAseq分析和無tRNA序列的基因序列分析。通過添加synII染色體的tRNA陣列。對于(E)和(F)其顯著性水平由熱圖顏色強度和符號大小表示。上調和下調的功能以紅色和綠色標注。
總結：雖然過去幾十年人們對于酵母的研究很多，但是我們對這種模式生物的理解仍然有限。本論文主要就酵母的synⅡ染色體進行了深度功能分析，首先就a-770的成酵母菌染色體的合成進行研究，同時完成了對該染色體的基因測序等相關工作。論文研究過程中我們有針對性調試的酵母的起源發展缺陷，通過使用Biosense微生物動態監測系統研究了含有synⅡ染色體的酵母和其他種類的酵母在甘油培養基37°C生長情況，通過對相關生長曲線分析，不同種類的酵母菌株盡管存在著細微的差別，這也說明了含有synII染色體的酵母菌株顯示出高度一致的生物學過程，可與原生菌株相媲美，這也表明Biosense微生物動態監測系統是在基因編輯領域也存在著很大的應用前景。
綜上，合成釀酒酵母II號染色體，是國際合成釀酒酵母基因組計劃(Sc 2.0)中重要組成部分。開啟“設計生命、再造生命和重塑生命”的進程，使我國成為繼美國之后第二個掌握真核生物基因組設計構建能力的國家。合成型釀酒酵母菌株可實現在多種壓力環境中超速進化，為合成酵母菌株的工業化應用方向注入新的動力，并有望在人類健康、生態、能源、工農業等領域產生重大影響（Yeast 2.0,Nature Communications專輯）。
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