沼澤紅假單胞菌R1菌株的培養基配方、培養條件、生長量及影響因素（一）
近年來，杜冰等（2007）對沼澤紅假單胞菌的生長條件進行了研究，發現pH值、溫度、接種量等因素影響沼澤紅假單胞菌的生長，并且它們之間又相互影響。夏冰冰等（2010）對沼澤紅假單胞菌發酵條件進行了響應面優化研究。全亞玲等（2012）對沼澤紅假單胞菌發酵培養基配方及培養條件進行了優化研究，采用單因素試驗設計分別對本實驗室保藏的沼澤紅假單胞菌培養的接種量、pH值、溫度、光照強度四種因素的不同水平進行比較試驗，確定其各自最佳試驗水平；確定了最佳培養基組成配方。本試驗旨在對實驗室保藏的沼澤紅假單胞菌R1菌株的培養基配方以及培養條件進行優化，簡化生產配方，降低生產成本，以期為產業化生產沼澤紅假單胞菌R1菌劑提供依據。
1材料與方法
1.1試驗材料
1.1.1菌種
沼澤紅假單胞菌R1：由河南省微生物工程重點實驗室保藏。
1.1.2培養基
菌種保藏培養基(ATYP瓊脂)：K2HPO41.0 g、CaCl20.1 g、NaHCO33.0 g、CH3COONa 1.0 g、MgCl20.5 g、NH4Cl 1.0 g、NaCl 1.0 g、微量元素溶液1.0 ml、維生素溶液1.0 ml、琥珀酸鈉1.0 g、酵母抽提物0.5 g、蛋白胨0.5 g、瓊脂12 g、蒸餾水1 000 ml，pH值6.8。
其中，微量元素溶液：FeCl2·4H2O 1.8 g、CoCl2·6H2O 0.25 g、NiCl2·6H2O 0.01 g、CuCl2·2H2O 0.01 g、MnCl2·4H2O 0.70 g、ZnCl20.1 g、H3BO30.5 g、Na2MoO4·2H2O 0.03 g、Na2SeO3·5H2O 0.01 g、蒸餾水1 000 ml。
維生素溶液：生物素0.1 g、煙酸0.35 g、鹽酸硫胺素0.3 g、對氨基苯甲酸0.2 g、鹽酸吡多胺0.1 g、泛酸鈣0.1 g、維生素B120.05 g、蒸餾水1 000 ml。
基本培養基：K2HPO41.0 g、CaCl20.1 g、NaHCO33.0 g、CH3COONa 1.0 g、MgCl20.5 g、NH4Cl 1.0 g、Na-Cl 1.0 g、微量元素溶液1.0 ml、維生素溶液1.0 ml、琥珀酸鈉1.0 g、酵母抽提物0.5 g、蛋白胨0.5 g、蒸餾水1 000 ml，pH值6.8。
雙層平板計數培養基：NH4Cl 1.0 g、K2HPO40.2 g、CH3COONa 3.0 g、NaHCO31.0 g、酵母膏0.2 g、NaCl 1.0 g、MgCl20.20 g、T.M.儲液1.5 ml、蒸餾水1 000 ml，pH值6.8。
其中T.M.儲液：FeCl35.0 mg、CuSO4·5H2O 0.05 mg、H3BO31.0 mg、MnCl2·5H2O 0.05 mg、ZnSO4·7H2O 1.0 mg、Co(NO3)2·6H2O 0.5 mg、蒸餾水1 000 ml。
雙層平板計數培養基中底層平板培養基添加0.8%瓊脂，上層平板培養基添加1.0%瓊脂。
1.1.3主要試劑
蛋白胨、酵母膏購自于北京奧博星生物技術有限公司；蔗糖、K2HPO4、NaHCO3、CH3COONa、（NH4）2SO4、NH4Cl、DL-蘋果酸、檸檬酸、丁二酸鈉、甘油、尿素等主要試劑均為分析純。
1.1.4主要儀器
YQX-Ⅱ厭氧培養箱、T6新世紀紫外可見光分光光度計、PHSJ-3F酸度計、T8-1磁力攪拌器、SW-CT-ICU超凈工作臺、YP2102電子天平、LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋、101型電熱鼓風干燥箱、DRP-9052型電熱恒溫培養箱。
1.2試驗方法
1.2.1沼澤紅假單胞菌液體菌種的制備
無菌操作條件下提取沼澤紅假單胞菌R1菌種2～3環接入裝有200 ml液體培養基的250 ml具塞磨口三角瓶中，30℃、40 W白熾燈距離20 cm處照射靜置厭氧光照條件下培養14 d，用作沼澤紅假單胞菌液體種子備用。
1.2.2沼澤紅假單胞菌R1培養基優化試驗
采用單因素試驗設計，分別對沼澤紅假單胞菌R1進行所需碳源試驗。選擇7種不同碳源（蔗糖、碳酸氫鈉、乙酸鈉、DL-蘋果酸、檸檬酸、丁二酸鈉、甘油）。所需氮源試驗，選擇5種不同氮源（蛋白胨、酵母膏、氯化銨、尿素、硫酸銨），然后根據發酵培養基碳源、氮源試驗的試驗結果，選擇適宜碳源、適宜氮源、磷酸氫二鉀為磷源、微量元素溶液、維生素溶液培養基成分作為5種因素，每個因素設計4個水平，設計正交試驗L16（45）。每250 ml具塞磨口三角瓶中裝有200 ml液體培養基，滅菌冷卻后接入10.0 ml液體菌種，30℃、40 W白熾燈距離20 cm處照射厭氧光照條件下靜置培養72 h，分析優化出沼澤紅假單胞菌R1較佳的培養基配方。
1.2.3沼澤紅假單胞菌R1培養條件試驗
采用單因素試驗設計，分別對沼澤紅假單胞菌R1優化后的培養基進行接種量試驗，按照體積比分別接入發酵培養基（2%、4%、6%、8%、10%）的液體種子；pH值試驗，分別調整發酵培養基初始pH值至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0；裝液量試驗，250 ml具塞磨口三角瓶中分別裝入液體培養基50、100、150、200 ml，滅菌冷卻后接入體積比5%液體菌種；培養溫度試驗（25、30、35、40℃）；光照試驗，分別選擇不同白熾燈（25、40、60、100 W）距離20 cm處照射培養。接種量試驗、pH值試驗、培養溫度試驗、裝液量試驗、光照試驗，每250 ml具塞磨口三角瓶中裝有200 ml液體培養基，滅菌冷卻后接入體積比5%，即10.0 ml液體菌種，白熾燈距離20 cm處厭氧光照條件下靜置培養72 h，分析出沼澤紅假單胞菌R1較佳的培養條件。
1.2.4生長量的測定
發酵培養液經充分振蕩搖勻后，采用T6新世紀紫外可見分光光度計，以培養初期剛接入菌種的液體培養基為空白對照，于660 nm處測定發酵培養液OD660值。
沼澤紅假單胞菌R1菌數含量的測定采用孫軍德等（2001）光合細菌雙層平板計數方法進行。
2結果與分析
2.1沼澤紅假單胞菌R1發酵培養基的篩選
2.1.1不同碳源試驗
ATYP瓊脂培養基為基本培養基，氯化銨為供試氮源，磷酸氫二鉀為磷源，加入1.0 g/l氯化銨、1.0 g/l磷酸氫二鉀、1.0 ml/l微量元素溶液、1.0 ml/l維生素溶液，再分別加入1.0 g/l的蔗糖、碳酸氫鈉、乙酸鈉、DL-蘋果酸、檸檬酸、丁二酸鈉、甘油制作培養基，接種沼澤紅假單胞菌R1培養7 d后，試驗結果見圖1。由圖1可知，沼澤紅假單胞菌R1較適宜的碳源為甘油。
2.1.2不同氮源試驗
以甘油為碳源，磷酸氫二鉀為磷源，加入1.0 ml/l微量元素溶液，1.0 ml/l維生素溶液，再分別加入蛋白胨、酵母膏、氯化銨、尿素、硫酸銨為唯一氮源配制培養基,接種沼澤紅假單胞菌R1培養7 d后，試驗結果見圖2。由圖2可知，沼澤紅假單胞菌R1較適宜的氮源為酵母膏，其次為蛋白胨，但考慮到酵母膏、蛋白胨使生產成本高，營養豐富易造成染菌等因素，因此本試驗選擇氯化銨為氮源。
圖1不同碳源對沼澤紅假單胞菌R1生長的影響
圖2不同氮源對沼澤紅假單胞菌R1生長的影響
沼澤紅假單胞菌R1菌株的培養基配方、培養條件、生長量及影響因素（一）
沼澤紅假單胞菌R1菌株的培養基配方、培養條件、生長量及影響因素（二）
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