青藏高原凍土區培養基分離解磷菌的生長曲線測定
本研究以青藏高原多年凍土區土壤為研究對象，利用有機磷和無機磷選擇性培養基分離解磷菌，通過測定菌株的溶磷圈、菌液中pH和上清液有效磷含量等指標分析解磷菌的解磷能力，結合不同干旱梯度和溫度梯度培養實驗評價菌株的抗逆能力，以期為解決青藏高原凍土區磷限制問題提供優良的菌株資源，將對干旱半干旱凍土區生態恢復具有重要意義。
研究區域和樣品采集
研究區域位于西藏自治區那曲市安多縣唐古拉山口附近(32°33′10.66′′N,91°50′3.97′′E)，是典型多年凍土分布區。該區域海拔5 100 m，全年大風日約100 d，年均降水量293–430 mm，年均氣溫?1.3–2.9℃[18]。區域內主要植被為紫花針茅(Stipa basiplumosa)、火絨草(Leontopodium leontopodioides)、羽柱針茅(Stipa subsessiliflora)、青藏苔草(Carex moorcroftii)和墊狀駝絨藜(Krascheninnikovia compacta)。土壤發育程度較低，多為石灰性土。
2022年8月，在唐古拉山口附近，距109國道垂直距離100–150 m范圍內采集0–10 cm的土壤樣品。通過五點取樣法采集2 kg土樣，并按四分法對采集的土樣進行混勻。混勻后的土樣分成2份：一份4℃保存用于解磷菌株分離；另一份土樣風干后過2 mm篩，用于全量養分測定。土壤pH值為8.2，有機碳含量為4.31 g/kg，全氮含量為3.08 mg/kg，全磷含量為0.53 g/kg。
1.2培養基
無機磷選擇性液體培養基(g/L)[19]：葡萄糖10.00，Ca3(PO4)2 5.00，(NH4)2SO4 0.50，NaCl 0.30，KCl 0.30，MgSO4·7H2O 0.30，FeSO4·7H2O 0.03，MnSO4·4H2O 0.03，酵母浸粉0.50，pH 7.0–7.5。
有機磷選擇性液體培養基(g/L)[20]：葡萄糖10.00，植酸鈣5.00，MgCl2·6H2O 5.00，MgSO4·7H2O 0.25，KCl 0.20，(NH4)2SO4 0.10，pH 6.8–7.0。
肉湯培養基(LB)(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母浸粉5.0，NaCl 10.0，pH 7.0–7.2。
固體培養基：在液體培養基中加入15.0 g/L瓊脂。
在進行實驗前，上述所有培養基以及實驗過程中所需的蒸餾水和涂布器等需要121℃滅菌20 min。
菌株生長曲線繪制
取OD600為0.1的菌懸液1 mL，轉接于50 mL的LB液體培養基中，在5、10、15、20、30℃條件下振蕩培養(180 r/min)，測定不同培養時間下菌液的OD600值，并分別以培養時間和OD600值為橫坐標和縱坐標繪制菌株生長曲線。
菌株生長曲線特征
菌株在不同培養溫度下的生長曲線如圖1所示。在30℃時，5株解磷菌在培養12–22 h后進入穩定期(圖1A)。在10、15、20℃時，i6、i9L、Qb和Qo在培養50 h后進入穩定期(圖1B、3C、3D)。在5℃時，i6、i9L、Qb和Qo進入到穩定期大約需要培養100 h，i5則需要培養140 h左右進入穩定期(圖1E)。進入穩定期的5株解磷菌OD600值比較結果顯示：Qb和Qo的OD600值在5–20℃時高于i5、i6和i9L的OD600值，在30℃時則低于i5、i6和i9L的OD600值。不同培養溫度下，進入穩定期的Qb和Qo的OD600值在15℃時最高(圖1)。
圖1五株解磷菌的生長曲線
結論
本研究利用選擇性培養基從青藏高原多年凍土區土壤中篩選出3株解無機磷菌(i5、i6和i9L)和2株解有機磷菌(Qb和Qo)。基于16S rRNA基因系統發育分析結果表明，5株解磷菌均為假單胞菌屬(Pseudomonas)。然而，5株菌在解磷能力、抗干旱和耐低溫能力等方面存在顯著的差異。通過解磷菌的溶磷指數、上清液pH和有效磷含量的測定，揭示了Qb和Qo解磷能力強于i5、i6和i9L的解磷能力。通過PEG6000模擬干旱脅迫處理以及低溫培養實驗發現，菌株Qo較其他菌株具備更強的耐干旱和低溫的能力。本研究將為青藏高原多年凍土區土壤難利用性磷活化提供重要菌株資源，對于支撐青藏高原凍土區土壤修復和植物生長具有重要意義。
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