莠去津對水稻根際土壤微生物菌群結構及降解基因豐度的影響（二）
2結果與分析
2.1莠去津對水稻根際土壤微生物多樣性的影響
對莠去津脅迫下水稻根際土壤的微生物多樣性進行分析，α多樣性結果如表1所示。各處理樣本覆蓋度均在98%以上，能較好地覆蓋樣本微生物群落的多數物種。另外，莠去津脅迫顯著降低了Sobs指數、Chao指數和Simpson指數，但對Shannon指數無顯著影響，表明莠去津脅迫可降低水稻根際土壤中細菌的豐富度和多樣性。
表1不同處理土壤中細菌α多樣性指標
為了分析莠去津對根際土壤細菌群落β多樣性的影響，在屬水平上進行了主坐標分析(PCoA)。結果表明：第一組分(PC1)和第二組分(PC2)的方差貢獻率分別為64.31%和17.7%，累計貢獻率為82.01%(圖1A)。另外，莠去津處理組樣品點和對照組樣品點在二維平面上能完全分開，說明莠去津可影響土壤細菌的群落結構。進一步篩選得到不同處理下存在顯著差異的優勢菌屬，結果如圖1B所示：莠去津處理顯著降低了戴沃斯菌屬(Devosia)、氫孢菌屬(Hydrogenispora)、代爾夫特菌屬(Delftia)的相對豐度，而噬氫菌屬(Hydrogenophaga)、瘤胃梭菌屬(Ruminiclostridium)、鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)和窄食單胞菌屬(Stenotrophomonas)的相對豐度則顯著增加。
圖1不同處理下水稻根際細菌在屬水平上的主坐標分析(PCoA)(A)和組間差異明顯的優勢菌屬(B)
2.2根際土壤中莠去津降解基因豐度的變化特征
土壤中莠去津降解基因(TrzN、AtzB、AtzC、AtzD、AtzE)豐度檢測結果如圖2所示，莠去津對不同降解基因豐度的影響存在差異。首先，相較于對照組，參與水解反應的基因TrzN、AtzB、AtzC在莠去津處理的根際土壤中豐度更高，其中TrzN基因的豐度為對照組的46倍，而基因AtzD和AtzE在不同處理之間無顯著差異。以上結果表明，莠去津處理會改變土壤中降解基因的豐度，影響根際土壤中降解功能菌菌群。
圖2莠去津處理對根際土壤中莠去津降解基因豐度的影響
2.3菌株AT2對莠去津脅迫下水稻生長的影響
通過分離篩選純化，獲得8株對莠去津具有降解功能的菌株，分別命名為AT1～AT8，對莠去津的體外降解率在40.8%～88.9%之間(表2)。根據16S rRNA基因序列同源性比對，發現8株菌株分別隸屬于假單胞菌屬(Pseudomonassp.)、芽孢桿菌屬(Bacillussp.)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillussp.)、金黃桿菌屬(Chryseobacteriumsp.)和腸桿菌屬(Enterobactersp.)。以其中降解能力最強的Pseudomonassp.AT2為目標菌株，通過對水稻株高、根長、干重、葉綠素和MDA含量進行測定，評估了接菌和未接菌水稻耐受莠去津脅迫的能力。結果如表3所示：在莠去津脅迫下，水稻生長明顯受到了抑制，葉綠素含量下降，同時伴隨著MDA含量增加，說明氧化脅迫增強。接種降解菌株AT2后，水稻中MDA含量與單獨莠去津處理組相比顯著下降，表明菌株AT2可緩解莠去津對水稻的氧化脅迫損傷。另外，在莠去津脅迫下，接菌處理組水稻的株高、根長、干重和葉綠素含量相較于未接菌組分別增加了34.6%、27.6%、28.6%和76.3%，進一步證明降解菌AT2對莠去津脅迫具有緩解作用。
表2 8株莠去津降解菌的篩選鑒定
表3莠去津脅迫下菌株Pseudomonas sp.AT2對水稻生長的影響
2.4菌株AT2對水稻和土壤中莠去津降解的影響
為明確降解菌AT2對土壤-水稻系統中莠去津降解的影響，測定了接菌和未接菌處理下水稻及土壤中莠去津的含量。結果顯示：接菌組水稻地上組織和根中莠去津的含量分別比未接菌組水稻低57.5%和47.1%，且莖葉中含量明顯高于根中含量；土壤中莠去津含量變化趨勢與水稻相似，接菌組土壤中莠去津含量顯著低于未接菌組，其含量僅為未接菌組土壤的85.1%(圖3)。研究表明，降解菌AT2可顯著促進土壤-水稻系統中莠去津的降解。為進一步評估AT2對水稻吸收和運輸莠去津能力的影響，分析了莠去津的富集系數(BCF)和轉運系數(TF)。由表4中結果可知，接種AT2后根和葉的富集系數均顯著下降，同時轉運系數也從3.34下降至2.68，表明接種菌株AT2減少了莠去津向水稻地上部分的轉運。
圖3接種Pseudomonas sp.AT2菌株對水稻和土壤中莠去津含量的影響
2.5菌株AT2對水稻中莠去津降解基因的影響
農藥在植物中的代謝主要通過三相代謝完成。為評估AT2對水稻中莠去津降解基因表達的影響，從已報道的莠去津降解基因中選擇6個參與I相和II相代謝的關鍵基因，測定了不同處理下降解基因的表達量。結果如圖4所示：在無莠去津脅迫情況下，接菌組水稻和未接菌對照組水稻中降解基因的表達量無顯著差異；莠去津脅迫下，水稻的防御系統被激活，莠去津降解基因的表達量顯著增加，其中P450基因的表達量是無莠去津脅迫對照組的10.7倍。另外，莠去津脅迫下，接菌組水稻中莠去津降解基因的表達量明顯高于未接菌組水稻，與未接菌組相比，接菌組水稻中編碼漆酶、甲基轉移酶、糖基轉移酶、P450、谷胱甘肽S-轉移酶和硫氧還蛋白的基因表達量分別提高了1.5、1.3、2.7、1.7、2.5和1.3倍。研究表明，接種降解菌AT2激活了水稻中莠去津的降解基因，從而可促進水稻中莠去津的降解代謝。
圖4不同處理下水稻中莠去津降解基因的表達量
3討論與結論
根際微生物是植物根際微域的重要組成部分，是衡量根際活力和質量的重要指標之一。農藥一方面可被植物直接吸收或殘留在土壤中，對植物根際微生物造成直接影響，另一方面還可通過改變植物的根系分泌物，從而間接影響根際微生物的結構。本研究發現，莠去津處理下，Sobs、Chao和Simpson指數均顯著下降，可能是莠去津進入土壤后抑制了根際微生物的活性，從而降低了水稻根際微生物的多樣性指數和豐富度指數。已有研究表明，當有機污染物進入土壤后，土壤中部分微生物能以有機污染物為碳源進行生長，并導致該部分微生物豐度增加。在本研究的細菌豐度分析中，發現莠去津處理顯著增加了水稻根際土壤中鞘氨醇桿菌屬、假單胞菌屬、金黃桿菌屬及芽孢桿菌屬的豐度，而這些菌屬均與有機污染物的降解密切相關。另外，在水稻根際土壤莠去津降解基因豐度變化的研究中，發現參與水解反應的降解基因TrzN、AtzB和AtzC的豐度受莠去津脅迫影響而顯著增加，推測可能在莠去津處理下，部分具有特定功能的菌株(如降解菌)豐度增加并協同植物促進對莠去津的降解，從而發揮抵御藥劑脅迫的作用。
目前已有研究表明，降解菌可有效緩解莠去津對后茬敏感作物的藥害。本研究在莠去津污染的根際土壤中分離篩選獲得8株莠去津降解菌，其中Pseudomonassp.AT2的降解能力最強。將菌株AT2接種于水稻根際，可有效緩解莠去津對水稻生長的抑制，接菌組水稻株高、根長、干重和葉綠素含量均顯著增加。MDA作為細胞膜脂質過氧化的產物，常用于評價植物的氧化脅迫程度。本研究發現，莠去津脅迫下，根際接種菌株AT2后，水稻體內MDA含量顯著下降，這可能是由于接種AT2增強了水稻對活性氧的清除能力，從而減輕莠去津對水稻的氧化脅迫損傷。
在農藥降解研究領域，目前已明確根際微生物可以聯合植物在農藥降解過程中發揮功效。Rani等研究發現，向日葵接種根際細菌菌株Paenibacillussp.ITISM08、Bacillussp.PRB77和Bacillussp.PRB101后，植物體內硫丹的積累量明顯減少，土壤中硫丹(初始質量濃度為5 mg/L)的降解率可達到92%。本研究發現，水稻根際接種菌株AT2不僅可顯著降低水稻根和葉中莠去津的積累量，同時還可促進土壤中殘留莠去津的降解，與Rani等的研究結果類似。據報道，農藥在植物中的代謝解毒主要通過植物酶系的誘導轉化實現。農藥進入植物后首先在細胞色素P450酶系(CYPs)、漆酶等酶系的作用下進行氧化、還原和水解等反應，進一步通過糖基轉移酶、谷胱甘肽S-轉移酶等酶系與植物體內的親水型分子結合形成II相代謝產物，同時降低對植物的毒性，該II相代謝產物隨后能被Ⅲ相代謝轉運子識別，將結合物沉積在液泡中或通過主動運輸排出至細胞間隙。本研究發現，莠去津脅迫下，參與水稻中I相(P450、漆酶)和II相代謝(甲基轉移酶、糖基轉移酶、谷胱甘肽S-轉移酶、硫氧還蛋白)的關鍵降解基因在菌株AT2作用下顯著上調表達，推測這可能是菌株AT2能夠促進水稻中莠去津降解，修復莠去津對水稻毒害的內在原因。
綜上，本研究揭示了莠去津脅迫可降低水稻根際細菌α多樣性，導致微生物群落結構發生改變，同時還可增加根際土壤中莠去津降解基因的豐度。另外，接種莠去津降解菌Pseudomonassp.AT2則能緩解莠去津對水稻的脅迫損傷，激活水稻中莠去津降解基因的表達，進而促進“土壤-水稻”系統中莠去津的降解代謝，阻控殘留莠去津向水稻地上部轉移富集。研究結果可為利用功能微生物定向修復殘留農藥污染，保障作物的安全生產提供理論基礎。
莠去津對水稻根際土壤微生物菌群結構及降解基因豐度的影響（一）
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