牦牛源短小芽孢桿菌生長曲線測定及藥敏試驗(yàn)、體外抑菌結(jié)果解讀（三）
2.4 TS1的藥敏試驗(yàn)結(jié)果
由表3可知，短小芽胞桿菌TS1對β-內(nèi)酰胺類、磺胺類、四環(huán)素類、喹諾酮類、氨基糖苷類、頭孢1/2/3/4代中常用的代表性藥物中的復(fù)方新諾明、阿米卡星、氧氟沙星、氨芐西林、青霉素、慶大霉素、多西環(huán)素、環(huán)丙沙星、阿莫西林、美羅培南和頭孢唑林極敏，對頭孢他啶產(chǎn)生耐藥，對頭孢噻肟和頭孢吡肟中度敏感，對頭孢呋辛高度敏感。
表3短小芽胞桿菌TS1的藥敏試驗(yàn)結(jié)果
2.5 TS1的體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果
由圖4可知:短小芽胞桿菌TS1對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和豬鏈球菌4種指示菌(革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌各2種)均產(chǎn)生較明顯的抑菌作用，抑菌直徑分別為18、21、28和23 mm，對革蘭氏陽性菌的抑菌作用更明顯，陰性對照組無抑菌圈(圖4-A—D)，說明TS1產(chǎn)生了抑菌產(chǎn)物;全菌液和菌體對大腸桿菌以及金黃色葡萄球菌都產(chǎn)生了抑菌圈，上清液以及陰性對照組無抑菌圈(圖4-E、F)，這可能與TS1的培養(yǎng)條件有關(guān)。
圖4短小芽胞桿菌TS1體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果
2.6 TS1的全基因組測序結(jié)果
由圖5可知，TS1基因全長為3 646 887 bp，GC含量約為42.09%。BAGEL4中的結(jié)果顯示其產(chǎn)生的抗菌肽與Amylocyclicin較為相近，且與數(shù)據(jù)庫里的抗菌肽比對后發(fā)現(xiàn)相似度只有48.90%，說明TS1產(chǎn)生的抗菌肽可能是一種新型抗菌肽。
圖5短小芽胞桿菌TS1全基因組測序及分析結(jié)果
3討論與結(jié)論
畜禽養(yǎng)殖中細(xì)菌耐藥性問題已日益嚴(yán)峻，對抗生素替代品的篩選和研究刻不容緩。益生菌添加劑不僅可以促進(jìn)動物生長，還可抑制致病菌，同時通過調(diào)節(jié)畜禽腸道菌群維持腸道上皮穩(wěn)態(tài)，從而促進(jìn)畜禽腸道健康。目前市面上所售動物用益生菌產(chǎn)品大多數(shù)為枯草芽胞桿菌(Bacillus ubtilis)，少數(shù)為地衣芽胞桿菌(Bacillus licheniformis)、蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)等。本試驗(yàn)從健康牦牛糞便中分離鑒定出了一株具有益生潛力的短小芽胞桿菌TS1。芽胞桿菌屬在惡劣的環(huán)境中可以形成芽胞而存活，因此具有抗逆性好、易保存的優(yōu)點(diǎn)。有研究表面，芽胞桿菌屬因容易在畜禽腸道中定殖而發(fā)揮益生作用。
畜禽養(yǎng)殖中可以應(yīng)用的益生菌應(yīng)具備生長性能強(qiáng)、耐受惡劣環(huán)境的特點(diǎn)，因此篩選出具有耐受強(qiáng)酸性、高膽鹽含量以及高溫條件的菌株具有重要意義。本試驗(yàn)篩選的短小芽胞桿菌TS1在pH3左右時的存活率為31.4%，在牛膽鹽濃度為0.3%時的存活率為65.4%，說明其具有較強(qiáng)的耐酸、耐膽鹽能力。畜禽胃中大多為強(qiáng)酸環(huán)境，腸道中的膽鹽含量為0.05%～0.3%，TS1具有較強(qiáng)的耐酸耐膽鹽能力，足夠數(shù)量的TS1可以通過胃腸，從而占據(jù)腸道生態(tài)位抑制致病菌的定殖，減少致病菌侵害。
TS1體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，TS1菌全菌液和離心后的菌體對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均具有一定的抑菌作用。有研究表明短小芽胞桿菌發(fā)揮抑菌作用可能是各種酶在發(fā)揮作用，也有研究認(rèn)為是細(xì)菌素的作用。本研究通過全基因組測序結(jié)果推測TS1發(fā)揮抑菌作用的物質(zhì)可能是抗菌肽Amylocyclicin，這是一種對革蘭氏陽性菌有高抗菌活性的新型細(xì)菌素。Amylocyclicin是環(huán)狀細(xì)菌素的一個成員，這是一類核糖體合成的多肽家族，它們因其熱穩(wěn)定性和高磷酸基團(tuán)(PI)值而區(qū)別于其他細(xì)菌素并普遍存在于芽胞桿菌類群中。在許多革蘭氏陽性細(xì)菌中都存在環(huán)狀細(xì)菌素。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的Amylocyclicin與其他環(huán)狀細(xì)菌素的同源性較低，如大腸桿菌的Carnocyclin(33.7%)、糞腸球菌的Enterocin(38.2%)、乳酸菌的Lactocyclicin(35.6%)。與同是芽胞桿菌FZB42的Amyloliquefaciens相比，同源性為48.9%，TS1 Amylocyclicin的核苷酸序列與芽胞桿菌屬的序列相似性為97%～99%。有研究表明Amylocyclicin發(fā)揮抑菌作用的主要機(jī)制是破壞致病菌細(xì)胞壁使其形成孔洞，其內(nèi)容物外泄，細(xì)菌因無法進(jìn)行正常代謝而死亡。因此，本試驗(yàn)所分離的TS1具有潛在的替代抗生素的應(yīng)用價值。Suda等研究表明芽胞桿菌產(chǎn)生抗菌肽的最適條件需采用BHI(brain heart infusion)培養(yǎng)基，于30℃有氧條件下振蕩(150 r·min-1)培養(yǎng)。還有研究表明果糖和Landy培養(yǎng)基也會促進(jìn)抗菌肽的產(chǎn)生和分泌。我們發(fā)現(xiàn)TS1序列中有編碼抗菌肽Amylocyclicin的基因簇，但本實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)TS1的培養(yǎng)上清液具有明顯的抗菌活性，推測該基因簇需要在一定的培養(yǎng)條件或者合適的培養(yǎng)基方可大量表達(dá)，對此尚需進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)條件進(jìn)行深入探究。
本研究所篩選出的牦牛源短小芽胞桿菌TS1，具備生長速度快、穩(wěn)定期時間長、抗逆性強(qiáng)、廣譜抗菌的特點(diǎn)，基本具備了畜禽飼料添加劑臨床使用的特性，具有開發(fā)成為畜禽用飼料添加劑的潛力。在此基礎(chǔ)上，我們發(fā)現(xiàn)TS1的基因組中存在一段較新的編碼抗菌肽的序列，其抑菌作用可能與此抗菌肽有關(guān)，但是具體的機(jī)制還需要進(jìn)一步探究。
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