不同碳源、氮源和金屬離子對(duì)耐鋅菌株的生長(zhǎng)特性的影響（一）
從造紙廠排污口的土壤中分離對(duì)鋅具有較強(qiáng)耐受性的菌株HXZ-1。菌株HXZ-1能夠在含鋅離子濃度為50 mg/L的液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，能耐受鋅離子的最高濃度為1000 mg/L。結(jié)合其生理生化特征和16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析，將該菌株鑒定為原小單孢菌屬(Promicromonosporasp.HXZ-1)。菌株HXZ-1最適培養(yǎng)條件為：鋅離子濃度為50 mg/L、葡萄糖為碳源、蛋白胨為氮源。當(dāng)鋅離子濃度為50 mg/L時(shí)，菌株HXZ-1對(duì)鋅吸附率最大，為29.1%；當(dāng)鋅離子濃度為500 mg/L時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間為10 h時(shí)，菌株HXZ-1吸附率最大，為18.8%。菌株HXZ-1是一株對(duì)鋅有較強(qiáng)抗性和吸附性的細(xì)菌，為重金屬污染的微生物修復(fù)提供參考。
隨著現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展，資源開發(fā)與利用為國(guó)家的建設(shè)和發(fā)展做出了巨大貢獻(xiàn)的同時(shí)，也造成了生態(tài)環(huán)境的破壞甚至生態(tài)失衡，比如采礦、冶金、煉油等重工業(yè)產(chǎn)生的污染物。越來越多的重金屬離子通過各種途徑進(jìn)入土壤和水體環(huán)境中，從而對(duì)生態(tài)環(huán)境和人體健康造成了重大影響[1]。
鋅是維持機(jī)體正常生長(zhǎng)發(fā)育、新陳代謝的重要物質(zhì)，曾被譽(yù)為“生命之花”[2]。鋅離子進(jìn)入環(huán)境后，它具有高毒性、難轉(zhuǎn)化、難遷移和生物富集等特性。其一旦進(jìn)入環(huán)境后不能被生物轉(zhuǎn)化，將參與食物鏈的循環(huán)，最終在人體內(nèi)富集，破壞人體內(nèi)正常的生理代謝，危害人體健康[3]。實(shí)驗(yàn)和流行病學(xué)調(diào)查證實(shí)，人體尿樣中含鋅量為1000μg/L以上時(shí)，人體處于鋅中毒狀態(tài)[4]。
微生物修復(fù)技術(shù)因其具有處理費(fèi)用低,對(duì)環(huán)境影響小、效率高等優(yōu)點(diǎn),在治理重金屬污染方面具有廣泛的應(yīng)用前景。近年來，利用環(huán)境中的微生物來修復(fù)重金屬離子對(duì)生態(tài)環(huán)境的污染問題逐漸引起人們的重視。如廖佳等從鉛鋅礦區(qū)分離篩選出耐鋅菌株AspergillusoryzaeHA，研究了不同試驗(yàn)條件對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響以及菌株對(duì)鋅離子的吸附[5]；樊霆等從某鋅尾砂壩土壤中篩選分離得到一株對(duì)鋅具有較強(qiáng)抗性的菌株AspergillusflavusCTB430-1，鋅對(duì)該菌株的最低抑菌濃度為800 mg/L[6]；王慧萍等從江西德興銅礦重金屬污染土壤中篩選得到一株菌株Sphingomonassp.DX-T3-03，可以抗25 mmol/L的鋅[7]；李慧芬等從鉛鋅尾礦區(qū)與污水灌溉區(qū)土壤中篩選到一株抗鋅的菌株StreptomycesciscaucasicusCCNWHX 72-14，對(duì)鋅的抗性達(dá)到845 mg/L[8]；李進(jìn)等從湖南資興鉛鋅礦區(qū)的尾砂礦礦渣中篩選到菌株VerticilliuminsectorumJ3，在最佳條件下對(duì)鋅的去除率為87.7%[9]。因此，從重金屬污染區(qū)土壤中分離耐性菌株用于治理重金屬污染，已成為生物修復(fù)生態(tài)環(huán)境的有效途徑[10-12]。
本研究從甘肅省某造紙廠排污口污水處，長(zhǎng)期受重金屬污染的土壤中篩選出一株具有抗鋅能力的菌株，通過其生理生化特征和16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定該菌株，通過不同碳源、氮源和金屬離子對(duì)其菌株HXZ-1生長(zhǎng)影響的研究，探討該菌株的生長(zhǎng)特性，為該菌在重金屬污染的微生物修復(fù)技術(shù)中提供理論依據(jù)。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1樣品采集
菌株由本實(shí)驗(yàn)室分離純化所得，樣品采自甘肅省某造紙廠排污口土壤的不同位置，裝塑料袋密封保存，備用。
1.1.2試劑和培養(yǎng)基
分子操作中所用的酶、抗生素均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司，PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，其余試劑為分析純。
LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5.0，蛋白胨10.0，NaCl 8.0，pH 7.0，固體培養(yǎng)基在上述培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入15 g/L的瓊脂。
1.1.3儀器與設(shè)備
分析天平(FA2104N)、恒溫振蕩培養(yǎng)箱(HZQ-X400)、分光光度計(jì)(722 s)購(gòu)于上海精密科學(xué)儀器有限公司；高壓式蒸汽滅菌鍋(YXQ-LS-50SII)購(gòu)于上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；超凈工作臺(tái)(SWCJ-1)購(gòu)于蘇州凈化設(shè)備；離心機(jī)(IS-R)購(gòu)于上海安亭科學(xué)儀器廠；Alpha凝膠成像系統(tǒng)(JS-780)購(gòu)于上海思伯明儀器有限公司。
1.2方法
1.2.1耐鋅菌株的馴化與分離
耐鋅菌株的分離采用梯度壓力馴化法[7]。稱取10 g待測(cè)污水樣品，加入100 mL無菌水中，30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，使細(xì)菌充分懸浮。移取1 mL培養(yǎng)液至另一盛有新鮮的5%LB培養(yǎng)基(含100 mg/L的ZnCl2)的三角瓶中于30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)5 d；移取l mL培養(yǎng)液至另一盛有新鮮的5%LB培養(yǎng)基(含200 mg/L的ZnCl2)的三角瓶中于30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)5 d；培養(yǎng)后依次移入含300、400、500、600、700、800、900和1000 mg/L ZnCl2的5%LB液體培養(yǎng)基中于30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)5 d。吸取適量菌液稀釋涂布于含有500 mg/L ZnCl2的固體LB培養(yǎng)基上，于30℃下培養(yǎng)48 h，挑取長(zhǎng)勢(shì)良好的單菌落，經(jīng)連續(xù)分離純化后，得到具有鋅抗性的菌株，編號(hào)為HXZ-1，將純化的菌培養(yǎng)后于冰箱中保存?zhèn)溆谩?
1.2.2生理生化特征鑒定
菌株形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)等參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[13]《Bergey′s Manual of Determinative Bacteriology》[14]等進(jìn)行。
1.2.3 16S rRNA基因PCR擴(kuò)增及其測(cè)序
采用高鹽法提取菌體的染色體總DNA[15]。以菌株的總DNA為模板，使用通用引物來擴(kuò)增菌株的16S rRNA基因。5′端引物為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(Escherichiacolibases 8～27)，3′端引物為5′-TACCTTGTTACGACTT-3′(E.colibases 1507～1492)。50μL的反應(yīng)體系：10×Buffer 5.0μL，MgCl2(25 mmol/L)4.0μL，dNTP(2.5 mmol/L)4.0μL，引物(1 mmol/L)各1.0μL，DNA模板(50.0 ng/μL)1.0μL，Taq酶(5.0 U/μL)0.5μL，超純水33.5μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，共30個(gè)循環(huán)；最后，72℃再延伸10 min。取PCR產(chǎn)物于0.75%的瓊脂糖凝膠上電泳。PCR產(chǎn)物由上海生工生物工程有限公司完成測(cè)序。
1.2.4菌株HXZ-1對(duì)不同碳源利用試驗(yàn)
試驗(yàn)測(cè)定的碳源分別為：葡萄糖、乳糖、蔗糖、淀粉、甘露醇、木糖、麥芽糖、阿拉伯糖。在無碳源培養(yǎng)基中分別加入不同碳源使其終濃度為0.5%。將菌株HXZ-1按3%(V/V)的接種量接種到裝有20 mL不同碳源培養(yǎng)基的三角瓶中，于30℃、150 r/min培養(yǎng)12 h，在600 nm下測(cè)吸光值，每個(gè)試驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)平行，取平均值。
1.2.5菌株HXZ-1對(duì)不同氮源利用試驗(yàn)
試驗(yàn)測(cè)定的氮源分別為：酵母粉、蛋白胨、硝酸鈉、硝酸銨、尿素、亞硝酸鈉、草酸銨。在無氮源培養(yǎng)分別加不同氮源使其終濃度為0.5%，將菌株HXZ-1按3%(V/V)的接種量接種到裝有20 mL不同氮源培養(yǎng)基的三角瓶中，于30℃、150 r/min培養(yǎng)12 h，在600 nm下測(cè)吸光值，每個(gè)試驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)平行，取平均值。
1.2.6不同鋅離子濃度對(duì)菌株HXZ-1生長(zhǎng)的影響
在50 mL三角瓶中分別裝入20 mL LB培養(yǎng)基，于120℃滅菌30 min。在培養(yǎng)基中加入ZnCl2母液，使其終濃度分別為0、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000和1200 mg/L，以1%的接種量分別接入處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的種子液，設(shè)置空白對(duì)照(不添加任何金屬離子)，于30℃，150 r/min培養(yǎng)11 h取樣，在600 nm下測(cè)吸光值，所有實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行，各樣品均設(shè)不接菌的空白對(duì)照。
1.2.7菌株HXZ-1在不同鋅離子濃度下的吸附試驗(yàn)[16]
1.2.8菌株HXZ-1在不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)鋅離子的吸附試驗(yàn)[17]
不同碳源、氮源和金屬離子對(duì)耐鋅菌株的生長(zhǎng)特性的影響（一）
不同碳源、氮源和金屬離子對(duì)耐鋅菌株的生長(zhǎng)特性的影響（二）
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