梅花鹿體細(xì)胞航天誘變、細(xì)胞樣品回收培養(yǎng)技術(shù)、生長曲線及核型特性（三）
2結(jié)果與分析
2.1航天誘變梅花鹿體細(xì)胞的回收與體外培養(yǎng)
由于航天誘變條件下的動物體細(xì)胞培養(yǎng)還沒有成熟的方法，本次實驗采用自主研發(fā)的PVDF膜培養(yǎng)法，梅花鹿體細(xì)胞樣品在太空飛行12 d后成功回收建系。其細(xì)胞經(jīng)過航天誘變處理后生長狀態(tài)良好，基本保持成纖維細(xì)胞特性（圖2）?；厥蘸蟮捏w細(xì)胞生長到80%匯合度后，其中一部分用于傳代培養(yǎng)，其余全部進(jìn)行冷凍保存。
2.2航天誘變組梅花鹿體細(xì)胞的生長曲線分析
根據(jù)3次實驗重復(fù)數(shù)據(jù)平均值得到的航天誘變組和對照組梅花鹿體細(xì)胞的生長曲線，總體均呈“S”型生長趨勢，對照組梅花鹿體細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)2 d后進(jìn)入對數(shù)生長期，航天誘變組梅花鹿體細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)4 d后進(jìn)入對數(shù)生長期。兩個體細(xì)胞系的細(xì)胞都在培養(yǎng)7 d后出現(xiàn)生長速度減慢的現(xiàn)象。由此得出航天誘變的梅花鹿體細(xì)胞能夠在體外培養(yǎng)生長正常。通過3次實驗重復(fù)結(jié)果來看，每個細(xì)胞系生長曲線分析結(jié)果穩(wěn)定（圖3）。
2.3航天誘變組和對照組雌性梅花鹿體細(xì)胞的擬合生長曲線分析
Logistic曲線模型能很好地擬合3組航天誘變組和對照組梅花鹿體細(xì)胞的生長曲線（表1），擬合度（R2）均接近1，說明其生長曲線的擬合度很好。拐點時間是細(xì)胞量增加速度由快到慢的轉(zhuǎn)折點，梅花鹿航天誘變組體細(xì)胞的拐點時間大于對照組拐點時間，即對照組梅花鹿體細(xì)胞早于航天誘變組樣品到達(dá)生長拐點。而從拐點細(xì)胞量來看，梅花鹿體細(xì)胞對照組的生長速度大于航天誘變組。
2.4航天誘變梅花鹿體細(xì)胞的核型
航天誘變組和對照組梅花鹿體細(xì)胞的細(xì)胞中期分裂相分析結(jié)果顯示，染色體數(shù)目2n為66的分裂相分別占90%和94%。利用細(xì)胞遺傳工作站（AI）軟件根據(jù)其染色體的形態(tài)結(jié)構(gòu)對染色體序列進(jìn)行排列。實驗觀察記錄了各100個航天誘變和對照組的梅花鹿體細(xì)胞染色體的形態(tài)，選擇分散良好且形態(tài)較好的中期分裂相進(jìn)行顯微攝影、放大、比對、排列（圖4）。梅花鹿染色體核型（karyotype）2n=66，其中，32對常染色體，1對性染色體，X染色體為最大的染色體。其中航天誘變的梅花鹿體細(xì)胞未出現(xiàn)異常，且染色體形態(tài)正常。
3討論
3.1梅花鹿體細(xì)胞的航天誘變及細(xì)胞樣品回收培養(yǎng)技術(shù)
動物體細(xì)胞的正常培養(yǎng)條件是用液體培養(yǎng)基，其基礎(chǔ)營養(yǎng)成分中需要進(jìn)一步添加血清并控制95%空氣和5%CO?的氣相條件，同時需要保持細(xì)胞滲透壓（osmotic pressure）在260~320 mOsm/kg（mOsm為milliosmol的縮寫，即毫滲量，是滲透壓的單位，1 mOsm/kg=2.575 kPa）和pH 7.2左右的酸堿度（power of hydrogen）。但是航天實驗從安全角度考慮，載物艙內(nèi)不能使用液體培養(yǎng)基，也沒有正常細(xì)胞培養(yǎng)的氣相控制條件，同時還伴有短時（10~20 min）高溫沖擊（溫度高于40℃），這些都是航天條件下進(jìn)行動物細(xì)胞培養(yǎng)所面臨的主要問題?；谝陨锨闆r我們研制了PVDF膜培養(yǎng)基技術(shù)，基本保證細(xì)胞生長所需營養(yǎng)、pH和滲透壓等基本條件。實驗結(jié)果顯示，利用自主研發(fā)的PVDF膜動物細(xì)胞培養(yǎng)法，可以使鹿體細(xì)胞樣品在太空艙內(nèi)飛行12 d后，保持細(xì)胞活力并成功回收建系。其細(xì)胞經(jīng)過航天誘變處理后生長狀態(tài)良好，基本保持成纖維細(xì)胞特性。這種動物體細(xì)胞太空培養(yǎng)方法的開發(fā)為以后進(jìn)行相關(guān)實驗提供了基礎(chǔ)技術(shù)支撐。
3.2生長曲線及擬合生長特點
本實驗采用臺盼藍(lán)染色直接計數(shù)法測定航天誘變組和對照組梅花鹿體細(xì)胞的生長曲線。實驗步驟中最關(guān)鍵的是，確定所有組接種的細(xì)胞量要一致，即每孔接種細(xì)胞量為1×10?；向血球計數(shù)板中加入培養(yǎng)液時要勻速緩慢；確保計數(shù)準(zhǔn)確，從而避免不必要的人為因素導(dǎo)致實驗結(jié)果不可信。通過3次重復(fù)的生長曲線測定實驗結(jié)果表明，本實驗的細(xì)胞計數(shù)板法計數(shù)結(jié)果穩(wěn)定性較好。Logistic模型參數(shù)在航天誘變組和對照組梅花鹿體細(xì)胞間存在差異，其中代表極限細(xì)胞量的A值有較小差異，這說明航天誘變組和對照組梅花鹿體細(xì)胞有差異；Logistic模型中B值（代表達(dá)到最大生長速率的參數(shù)）也存在差異，即航天誘變組梅花鹿體細(xì)胞最大生長速率出現(xiàn)得較對照組梅花鹿體細(xì)胞遲。航天誘變組和對照組梅花鹿體細(xì)胞生長速率參數(shù)差異很小。實驗數(shù)據(jù)結(jié)果證明了對照組體細(xì)胞的生長速度大于航天誘變組生長速度。雖然航天誘變組體細(xì)胞生長速度不如對照組生長速度快，但其生長特性正常且良好。擬合生長曲線分析表明，與對照組相比航天誘變組細(xì)胞生長擬合度值相似，但細(xì)胞增殖拐點時間、拐點細(xì)胞量分析結(jié)果證明，航天誘變后的體細(xì)胞增殖速度減慢。增殖速度減慢有極大可能與細(xì)胞生長周期相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)。近幾年來，很多科研工作將較多的精力致力于細(xì)胞骨架系統(tǒng)中不同因素對細(xì)胞骨架分子聚合、解聚組裝的影響、細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)的信號傳導(dǎo)途徑和基因表達(dá)研究。同時也有結(jié)果表明，重力可直接影響微管分子自組裝過程；微重力或模擬失重引起的細(xì)胞外基質(zhì)或整合素表達(dá)變化可影響ERK信號傳導(dǎo)途徑。因此后期實驗將以航天誘變處理的梅花鹿體細(xì)胞回收后生長速度減慢為依據(jù)，篩選出與細(xì)胞生長周期相關(guān)基因CCNE1、CDC34、CDK6、CKS2及ABL1，比較它們在對照組和航天誘變組梅花鹿體細(xì)胞中的表達(dá)量，從而為進(jìn)一步了解航天誘變對梅花鹿體細(xì)胞影響提供理論依據(jù)。
3.3航天誘變梅花鹿體細(xì)胞核型
本實驗采用低滲滴片法制備染色體標(biāo)本。實驗步驟中最關(guān)鍵的是，控制適宜的低滲時間，低滲時間過長導(dǎo)致細(xì)胞破裂，低滲時間不夠使得染色體鋪展不好；另外將玻片提前20~30 min放入?20℃的冰箱中，使用前5 min放入4℃冰柜中，確保在滴片時玻片上有一層水膜，也可提高中期分裂相的分散程度并得到理想的核型分析圖。本研究獲得了大量清晰的梅花鹿體細(xì)胞中期染色體相，觀察結(jié)果表明，航天誘變并沒有導(dǎo)致梅花鹿體細(xì)胞染色體形態(tài)和數(shù)量的變化，也沒有引起梅花鹿體細(xì)胞在細(xì)胞水平的遺傳學(xué)變化。由此推斷航天誘變過程中微重力（microgravity）、太空電磁波、太空輻射等與地球表面不同的物理條件可能導(dǎo)致梅花鹿體細(xì)胞在基因水平或基因表達(dá)水平上的某些變化。有關(guān)這一方面的研究，下一步我們將通過基因組和轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)進(jìn)一步研究其中的原因。
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