適用于貴州貞豐地區的發酵床微生物菌劑生長曲線
發酵床技術從2004年從日本引進到國內，從原先單一菌劑發酵床到復合菌劑發酵床的開發應用，使得發酵床技術逐步穩定成熟。發酵床菌劑應用廣泛，在用于制作發酵床方面，可以達到分解動物糞便的目的，從而增加效益、減少污染等。
貴州地處喀斯特地貌，多氣候的特殊環境，微生物菌劑在貴州產酶、產孢等能力減弱。此外，貴州不同地區環境氣候等差異較大，同一株微生物在不同地區的繁殖代謝能力也不一樣。
目前，現有的發酵床菌種在貴州地區的應用存在以下缺陷：
1.現有發酵床菌種復合配方同質化嚴重，并且在貴州的實際表現能力較差，死床率高等。
2.現有發酵床菌種成本高，效果不佳，應用時間短。
為此，下面一種適用于貴州貞豐地區的發酵床菌劑及制備方法，以解決上述問題。
在貞豐地區采集土著微生物，并在實驗室分離培養發酵床核心菌群，對核心菌群的生長曲線，代謝酶濃度測定評估，組合形成適用于貴州貞豐地區的發酵床菌劑配方。涉及的菌種及配方能較高適宜貞豐地區發酵床應用及持續穩定運營。
菌種保藏
芽孢桿菌：拉丁學名為Bac i l l us sp.，保藏于中國廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號為GDMCC NO：63150。
乳球菌：拉丁學名為：Lactococcus sp.，保藏于中國廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號為GDMCC NO：63149。
植物乳桿菌：拉丁學名為：Lact i p l ant i bac i l l us p l antarum，保藏于中國廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號為GDMCC NO：63152。
酵母菌：拉丁學名為Saccharomyces sp.，保藏于中國廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號為GDMCC NO：63151。
屎腸球菌，拉丁學名為Enterococcus faec i um，保藏于中國廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號為GDMCC NO：63145。
乳球菌的生長曲線圖；
芽孢桿菌的生長曲線圖；
酵母菌的生長曲線圖；
屎腸球菌的生長曲線圖；
適用于貴州貞豐地區的發酵床菌劑及制備步驟：
1)、采樣：將7分熟的米飯裝入采樣木盒中，滴上6-7mL營養液，放入貞豐長田鎮甘田村深山內，挖坑將培養盒放入，用腐殖土和白色菌絲體土壤覆蓋，并在四周挖排水溝，防止水直接進入培養土坑中，7日后返回收集樣本。
2)、樣品前處理：用1:1甘油保存液將部分樣本進行保種；取1mL液體，用9mL生理鹽水稀釋，記住10-1濃度，以此方法逐級稀釋至10-5、10-6濃度，選用肉湯培養基和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基進行初篩，將10-5、10-6濃度的稀釋液各取1mL涂布于肉湯培養基和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基中，36℃培養72h。
3)、培養基配制：肉湯瓊脂培養基(牛肉粉5g、蛋白胨20g、氯化鈉5g、瓊脂15g、水1000mL、pH7.0～7.2),馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA培養基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g、瓊脂15g、水1000mL)，屎腸球菌選擇性培養基(月示胨10g，麥芽糖10g，酵母粉10g，甘油磷酸鈉10g，氯化鈉5g，乳糖1g，溴甲酚紫0.015g，疊氮鈉0.4g，TCC 0.1g，瓊脂13g)，LB瓊脂胨培養基(胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g、氯化鈉10g、瓊脂15g、水1000mL、pH6.9～7.1)、MRS瓊脂培養基(胰酪胨10g、牛肉膏粉5g、酵母粉4g、葡萄糖20g、乙酸鈉5g、檸檬酸三胺2g、吐溫80 1g、磷酸二氫鉀2g、硫酸鎂0.2g、硫酸錳0.05g、瓊脂15g、水1000mL、pH6.0～6.4)，酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養基(YPD瓊脂培養基：蛋白胨20g、葡萄糖20g、酵母浸粉10g、瓊脂15g、水1000mL、pH6.3～6.7)，LB液體胨培養基(胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g、氯化鈉10g、水1000mL、pH6.9～7.1)、MRS液體培養基(胰酪胨10g、牛肉膏粉5g、酵母粉4g、葡萄糖20g、乙酸鈉5g、檸檬酸三胺2g、吐溫80 1g、磷酸二氫鉀2g、硫酸鎂0.2g、硫酸錳0.05g、水1000mL、pH6.2～6.4)，酵母浸出粉胨葡萄糖液體培養基(YPD液體培養基：蛋白胨20g、葡萄糖20g、酵母浸粉10g、水1000mL、pH6.3～6.7)。
4)、菌種復篩：初篩菌種培養結束后，從肉湯培養基上選取1-2株菌落分別在MRS瓊脂、LB瓊脂、屎腸球菌選擇性培養基上進行涂布，38℃培養72h；從PDA瓊脂培養基上選取形態結構較大菌落在YPD瓊脂培養基涂布，30℃培養7d。
5)、菌種鑒定檢測：從4組培養基中分離出的菌種通過析澤生物Z200菌落計數器進行菌落形態分析，結合菌種生長形態結構初判菌種種類；其次將菌泥使用革蘭氏染液染色后進行鏡檢；無法判斷的菌種再培養后送往蘇州帕米諾克生物公司測序鑒定。
6)、菌種生長曲線檢測：將分離純化的菌種按照5％的菌液接種量接種到對應液體培養基中，每隔1h取樣5mL，利用普析T6紫外分光光度計在620nm測定菌種OD值。
7)、產品對照實驗：采購某品牌發酵床菌劑10kg，取1g菌粉置于肉湯培養基中進行培養，38℃培養72h；分離純化貴州地區菌種主要為芽孢桿菌、乳球菌、植物乳桿菌、屎腸球菌、酵母菌等，將分離純化菌種在對應培養基中進行擴繁培養，培養結束后使用盧湘儀18M離心機離心，將離心菌泥與保護劑1:1混合后使用四環福瑞0.05平方實驗室小型凍干機凍干32h，凍干后的單菌粉其復合比例為4:1:1:2:2，將復合后的復合菌粉1g也置于肉湯培養基中38℃培養72h。將培養好的菌液測定其活菌數、pH、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶。
8)、貞豐地區驗證實驗：將市場產品和復合好的貞豐地區菌種產品都按1:5與玉米面混合撒勻在甘田村發酵床上進行產品臨床實驗，每月進行1次采樣，采樣后測定活菌數、pH、酶活等。
結果表明：乳球菌在48h時達到最大峰值，芽孢桿菌和酵母菌在20-30h之間達到峰值，生產繁殖情況較市場購買菌種優異。
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