微生物生長動(dòng)態(tài)監(jiān)測系統(tǒng)的應(yīng)用：研究β-內(nèi)酰胺類抗生素對(duì)絲狀化的誘導(dǎo)能力
研究背景：β-內(nèi)酰胺類抗生素能夠改變細(xì)菌細(xì)胞壁的形狀，導(dǎo)致細(xì)菌絲狀化或球形化。絲狀化發(fā)生在細(xì)胞分裂被阻斷但生長繼續(xù)進(jìn)行時(shí)，形成長度可達(dá)其桿狀細(xì)胞50倍的絲狀細(xì)菌。絲狀形態(tài)提供了生存優(yōu)勢，如抑制免疫細(xì)胞的吞噬作用、促進(jìn)在宿主組織內(nèi)的生存，并減少對(duì)某些抗菌劑的敏感性。然而，絲狀化并不能直接與抗生素敏感性或抗藥性相關(guān)聯(lián)，但在早期AST中是關(guān)鍵知識(shí)。β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物被廣泛用于治療感染；然而β-內(nèi)酰胺類耐藥性令人擔(dān)憂的蔓延在全球范圍內(nèi)越來越多地被報(bào)道，并代表著一個(gè)重大的健康問題。腸桿菌科細(xì)菌對(duì)青霉素類和頭孢菌素最重要的耐藥機(jī)制是廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBL）。在本研究中，研究人員提出了一種圖像分析算法，可量化細(xì)菌的長度，從而量化細(xì)菌形態(tài)的變化。這在檢測青霉素類、頭孢菌素類、碳青霉烯類和單內(nèi)酰胺類等抗生素時(shí)尤為重要。眾所周知，β-內(nèi)酰胺類抗生素可誘導(dǎo)細(xì)菌發(fā)生形態(tài)學(xué)變化（如絲狀或球形體形成）。因此，快速檢測這些變化可能具有重要的臨床意義。β-內(nèi)酰胺類抗生素能夠改變細(xì)菌細(xì)胞壁的形狀，導(dǎo)致細(xì)菌絲狀化或球形化。絲狀化發(fā)生在細(xì)胞分裂被阻斷但生長繼續(xù)進(jìn)行時(shí)，形成長度可達(dá)其桿狀細(xì)胞50倍的絲狀細(xì)菌。
絲狀形態(tài)提供了生存優(yōu)勢，如抑制免疫細(xì)胞的吞噬作用、促進(jìn)在宿主組織內(nèi)的生存，并減少對(duì)某些抗菌劑的敏感性。然而，絲狀化并不能直接與抗生素敏感性或抗藥性相關(guān)聯(lián)，但在早期AST中是關(guān)鍵知識(shí)。β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物被廣泛用于治療感染；然而β-內(nèi)酰胺類耐藥性令人擔(dān)憂的蔓延在全球范圍內(nèi)越來越多地被報(bào)道，并代表著一個(gè)重大的健康問題。
腸桿菌科細(xì)菌對(duì)青霉素類和頭孢菌素最重要的耐藥機(jī)制是廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBL）。在本研究中，研究人員提出了一種圖像分析算法，可量化細(xì)菌的長度，從而量化細(xì)菌形態(tài)的變化。這在檢測青霉素類、頭孢菌素類、碳青霉烯類和單內(nèi)酰胺類等抗生素時(shí)尤為重要。眾所周知，β-內(nèi)酰胺類抗生素可誘導(dǎo)細(xì)菌發(fā)生形態(tài)學(xué)變化（如絲狀或球形體形成）。因此，快速檢測這些變化可能具有重要的臨床意義。
oCelloScope微生物生長動(dòng)態(tài)監(jiān)測系統(tǒng)的應(yīng)用
丹麥BioSense推出的微生物生長動(dòng)態(tài)監(jiān)測系統(tǒng)（oCelloScope）能自動(dòng)測量微生物的生長動(dòng)力學(xué)與形態(tài)學(xué)，同步給出微生物生長早期階段的生長曲線和形態(tài)學(xué)動(dòng)態(tài)變化。oCelloScope是一種數(shù)字延時(shí)顯微鏡技術(shù)，可掃描流體樣品，生成一系列圖像，使用oCelloScope系統(tǒng)進(jìn)行時(shí)間推移顯微成像，每15分鐘掃描一次，持續(xù)12小時(shí)。使用自定義的MATLAB腳本進(jìn)行圖像處理和分析。oCelloScope系統(tǒng)有能通過頭孢菌素與β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的組合，快速確定產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌（如ESBL產(chǎn)菌）的表型。頭孢菌素與β-內(nèi)酰胺酶抑制劑聯(lián)合產(chǎn)生超廣譜β-內(nèi)酰胺酶。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論
本文提出了一種自動(dòng)化的基于圖像的算法，能夠檢測抗生素誘導(dǎo)的絲狀化。這種方法有助于提高AST的準(zhǔn)確性，消除自動(dòng)系統(tǒng)中的誤判。通過快速準(zhǔn)確地檢測絲狀化和抗藥性，oCelloScope系統(tǒng)可以作為早期預(yù)測抗藥性細(xì)菌的工具。使用三種不同抗藥性和絲狀化動(dòng)力學(xué)的E.coli菌株，研究了一種新型圖像分析算法，以量化細(xì)菌長度和絲狀化。研究了12種β-內(nèi)酰胺抗生素或β-內(nèi)酰胺酶抑制劑組合對(duì)絲狀化的誘導(dǎo)能力。絲狀化在大約120分鐘時(shí)達(dá)到峰值，平均細(xì)胞長度為30微米。
圖1、光鏡下抗生素誘導(dǎo)大腸桿菌成絲。頭孢噻肟(8mg/L)處理后的大腸桿菌ATCC259222的抗生素誘導(dǎo)成絲，光鏡下10倍(a)和100倍(b)放大。
圖2、哌拉西林對(duì)oCelloScope系統(tǒng)獲得的大腸桿菌生長和長度的影響。a)采用兩種不同的算法對(duì)未經(jīng)處理(點(diǎn)線)和頭孢噻肟處理(實(shí)線)的大腸桿菌進(jìn)行細(xì)菌生長動(dòng)力學(xué)和成絲的定量測定:生長動(dòng)力學(xué)(藍(lán)色圖)是基于分割和提取表面積測量的，細(xì)菌長度(綠色圖)是基于分割提取的平均長度測量的。8 mg/L頭孢噻肟處理后，oCelloScope系統(tǒng)分別在(b)60 min、(c)120 min、(d)180 min和(e)240 min時(shí)獲得大腸桿菌的形態(tài)學(xué)圖像。
圖3、β-內(nèi)酰胺-β-內(nèi)酰胺酶抑制劑聯(lián)合應(yīng)用于抗生素誘導(dǎo)產(chǎn)esbl大腸桿菌成絲的早期檢測。哌拉西林/他唑巴坦(32/4 mg/L)(a-b)或替卡西林/克拉維酸(32/2 mg/L)(c-d)處理大腸桿菌的生長動(dòng)力學(xué)和平均細(xì)菌長度。哌拉西林/他唑巴坦誘導(dǎo)的微絲(長度增加>5μm)可在30 min內(nèi)檢測到，而替卡西林/克拉維酸誘導(dǎo)的微絲缺失可在40 min內(nèi)檢測到。
圖4、β-內(nèi)酰胺-β-內(nèi)酰胺酶抑制劑組合對(duì)大腸桿菌生長動(dòng)力學(xué)的影響。對(duì)照菌株大腸桿菌、產(chǎn)esbl大腸桿菌和血培養(yǎng)大腸桿菌分別用4種不同濃度的哌拉西林單獨(dú)(a-c)或補(bǔ)充他唑巴坦(d-f)和噻卡西林單獨(dú)(g-i)或補(bǔ)充克拉維酸(j-1)處理。每隔15 min重復(fù)測定生長動(dòng)力學(xué)，持續(xù)10 h。
圖5、β-內(nèi)酰胺-β-內(nèi)酰胺酶抑制劑組合對(duì)大腸桿菌細(xì)菌長度的影響。對(duì)照菌株大腸桿菌、產(chǎn)esbl大腸桿菌和血培養(yǎng)大腸桿菌分別用4種不同濃度的哌拉西林單獨(dú)(a-c)或補(bǔ)充他唑巴坦(d-f)和噻卡西林單獨(dú)(g-i)或補(bǔ)充克拉維酸(j-1)處理。每15 min重復(fù)測量細(xì)菌長度，持續(xù)10 h。
總結(jié)
β-內(nèi)酰胺類抗生素能夠改變細(xì)菌細(xì)胞壁的形狀，如形成絲狀或球形細(xì)胞。在依靠比色法或濁度法（如Vitek2、Phoenix、MicroScan WalkAway）的系統(tǒng)中，細(xì)菌的絲狀化可能會(huì)被誤認(rèn)為是生長，從而使抗菌藥敏感性的早期測定變得復(fù)雜。本論文研究的目的是利用三維數(shù)碼顯微成像系統(tǒng)oCelloScope，研究一種量化絲狀細(xì)菌的自動(dòng)圖像分析算法。利用三種耐藥性不同且絲狀化動(dòng)力學(xué)不同的大腸桿菌菌株，研究了一種量化細(xì)菌長度和細(xì)菌絲狀化的新型圖像分析算法。共分析了12種β-內(nèi)酰胺類抗生素或β-內(nèi)酰胺酶抑制劑組合誘導(dǎo)菌絲生長的能力。絲狀化在大約120分鐘時(shí)達(dá)到頂峰，細(xì)胞平均長度為30μm。自動(dòng)圖像分析算法顯示了快速檢測和量化大腸桿菌中β-內(nèi)酰胺誘導(dǎo)的絲狀化的明顯能力。這種快速測定β-內(nèi)酰胺介導(dǎo)的形態(tài)學(xué)改變的方法可促進(jìn)未來快速、準(zhǔn)確AST系統(tǒng)的開發(fā)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)早期靶向抗菌治療。因此快速檢測β-內(nèi)酰胺介導(dǎo)的形態(tài)學(xué)變化可能具有重要的臨床意義。
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