生防菌株不同生長階段時發(fā)酵液色素與OD650 nm的變化
摘要：真菌GD-2和HZ-31是2株分離于雜草中的具有生防潛力的生防菌株，為進一步研究2株菌株的發(fā)酵培養(yǎng)及田間應用技術，進行了生防菌株生長特性研究。通過室內(nèi)PAS培養(yǎng)基培養(yǎng)，裝液量為100 mL/250 mL，培養(yǎng)溫度（25±1）℃，培養(yǎng)10 d，觀察測定培養(yǎng)過程中發(fā)酵液顏色、菌絲干重變化、OD650 nm和pH，并利用聚類分析方法劃分生防菌株生長階段。結果表明，在培養(yǎng)過程中，生防菌株發(fā)酵液的顏色、菌絲干重、OD650 nm和pH都會隨著培養(yǎng)時間而變化。在相同的培養(yǎng)條件下，來源于不同寄主的生防菌菌株之間在顏色、菌絲干重變化、OD650 nm和pH變化表現(xiàn)出差異。2株生防菌菌株的生長分為3個階段，1～2 d為適應階段，3～5 d為對數(shù)生長階段，6～10 d為穩(wěn)定階段。生防菌株在培養(yǎng)過程的發(fā)酵液色素變化和OD650 nm的變化可作為生防菌株培養(yǎng)的表征性特征。
真菌在生長、產(chǎn)孢、萌發(fā)時對營養(yǎng)和環(huán)境條件都有其基本的和特殊的需求，了解真菌生長、產(chǎn)孢和萌發(fā)的具體特性和要求，對植物真菌病害的研究具有重要意義。不同真菌在不同地區(qū)的分布又有所不同，這種差異反映了生防菌對生長環(huán)境的選擇，表現(xiàn)在其對不同環(huán)境利用的生長特性上。在特定的培養(yǎng)條件下，真菌發(fā)酵液的顏色、菌絲干重、發(fā)酵液吸光度和pH等的變化，都能反映真菌的生長特性。針對篩選出的具有良好生防潛力的2株真菌，研究生長特性，了解適宜培養(yǎng)條件，對進一步研究該菌株的生物防治應用具有重要意義。菌株GD-2和HZ-31是青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點實驗室篩選出的對野燕麥具有防除效果的生防菌株[1，2]，本研究對該生防菌株的生長特性進行了研究，有助于了解其培養(yǎng)特性的差異，尋找培養(yǎng)過程的異質(zhì)性指標，為進一步的生物學研究發(fā)酵生產(chǎn)、制劑研制及田間應用等奠定基礎。
1材料及方法
1.1試驗材料
菌株：供試菌株及來源見表1。
培養(yǎng)基：固體培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL）；液體培養(yǎng)基為PSA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，水1 000 mL）。
1.2試驗方法
生防菌株培養(yǎng)：將生防菌在PDA平板上培養(yǎng)7 d，打取3個6 mm的菌片，置于盛有100 mL PSA液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為（25±1）℃，搖床轉速為110 r/min，每天取3瓶，過濾菌絲，收集發(fā)酵液。
觀察測定：①觀察生防菌株生長過程發(fā)酵液顏色的變化。②測定生防菌株生長過程菌絲干重的變化。收集發(fā)酵液在5 000 r/min離心15 min，倒掉上清液后菌體用去離子水洗滌，離心，反復3次后放到50℃的烘箱中烘至恒重，在分析天平上準確稱重。③測定生防菌株生長過程OD650 nm的變化。將發(fā)酵液5 000 r/min離心，取上清液，用UV751GD型分光光度計（上海精科）測定OD650 nm。④測定生防菌株生長過程中pH的變化，分析生防菌株的生長特性。
分析生防菌株的生長階段，以生防菌株培養(yǎng)時間為分類，以菌株GD-2和HZ-31的菌絲干重、OD650 nm、pH為指標，構建矩陣。以歐氏距離為相關尺度，用類平均法進行聚類分析。
1.3統(tǒng)計分析
采用Eecel軟件作圖，DPS軟件進行數(shù)據(jù)分析。
2結果與分析
2.1生防菌株生長過程發(fā)酵液顏色的變化
2株生防菌株在培養(yǎng)過程顏色變化不同。發(fā)酵液顏色會發(fā)生階段性變化，在發(fā)酵初期（1～3 d），生防菌菌株GD-2和HZ-31的發(fā)酵液顏色與培養(yǎng)基配制時的顏色相同，沒有明顯的變化。在發(fā)酵中期（4～6 d），2株菌株發(fā)酵液的顏色發(fā)生明顯變化，菌株GD-2發(fā)酵液在4 d時變?yōu)槟厅S色，在6 d時顏色加深，轉變?yōu)辄S褐色；而菌株HZ-31發(fā)酵液在4 d時則變?yōu)榈S色，在6 d時顏色加深轉變?yōu)樯铧S色。在發(fā)酵后期（7 d以后），2株生防菌發(fā)酵液保持發(fā)酵6 d時的顏色，沒有明顯變化。
2.2生防菌株生長過程中菌絲干重的變化
菌株GD-2和菌株HZ-31培養(yǎng)過程中菌絲干重的變化趨勢相差較大，2株菌株的菌絲干重增加量情況存在較大差異（圖1）。菌株GD-2菌絲干重增加量最大的時間為5～8 d，8 d時的菌絲干重達到最大值（499.8 mg/100 mL），隨后的變化趨于平緩。而菌株HZ-31增加量最大的時間為1～4 d；4 d時的菌絲干重達到最大值，為834.4 mg/100 mL，隨后菌絲干重急劇下降。在培養(yǎng)初期菌株HZ-31的生長速度快于GD-2菌株，到培養(yǎng)后期HZ-31菌絲干重明顯低于GD-2菌株菌絲干重，2株菌株的菌絲干重的變化出現(xiàn)明顯差異，這可能與菌株的生物學特性和對培養(yǎng)基的適應性有關。
2.3生防菌株生長過程中OD650 nm的變化
由吸光度得到的生長曲線可以認為是微生物生長狀況的宏觀表現(xiàn)。通過測定不同培養(yǎng)時間的OD650 nm，可大體劃分微生物生長的不同生長時期，為批量生產(chǎn)提供依據(jù)。菌株GD-2和菌株HZ-31發(fā)酵過程中發(fā)酵液離心上清液的OD650 nm變化如圖2。2株菌株發(fā)酵過程中變化趨勢基本類似，隨著發(fā)酵進程OD650 nm逐漸增高，在發(fā)酵中期出現(xiàn)最高峰值，但是不同的菌株出現(xiàn)峰值的時間不同。GD-2菌株出現(xiàn)2個峰值，在3 d和5 d分別為0.103和0.114，之后OD650 nm變化幅度較大，8 d時達到最低峰（0.027）；而HZ-31變化較緩慢，7 d時達到最低峰（0.027）。
2.4生防菌株生長過程中pH的變化
菌株GD-2和菌株HZ-31發(fā)酵過程中pH的變化趨勢相差較大（圖3）。菌株GD-2培養(yǎng)初期（1～3 d），pH為6.50～6.19，培養(yǎng)中期（4～6 d），pH為5.78～5.87，此時pH上升很快，培養(yǎng)后期（7～10 d），pH為6.02～8.34，變化最快，在培養(yǎng)的2～5 d，pH有所下降。菌株HZ-31從培養(yǎng)初期的6.23逐漸升高為培養(yǎng)后期的9.08～9.04，在4 d時略有波動，從5 d開始，pH的變化趨于平緩。結果表明，2株菌株發(fā)酵液的pH從最初的6.2左右逐漸升高8.34和9.04，培養(yǎng)過程中2株菌株pH變化過程差異較大。
2.5生防菌株生長階段聚類分析
用聚類分析方法對培養(yǎng)時間進行歸類。以培養(yǎng)時間為分類，以菌株GD-2和HZ-31的菌絲干重、OD650 nm、pH為指標，構建矩陣，用歐氏距離為相關尺度，以類平均法進行系統(tǒng)聚類，聚類過程見表2。培養(yǎng)時間對菌絲干重、OD650 nm、pH影響見圖4。分析結果表明，當λ=81.5時，可將生防菌菌株的生長分為3個階段，第一個階段為適應期，培養(yǎng)時間為1～2 d，菌株的菌絲干重、OD650 nm、pH變化較小，菌株生長處于適應階段。第二階段為對數(shù)期，培養(yǎng)時間為3～5 d，菌株的菌絲干重、OD650 nm、pH變化較大，菌株處于對數(shù)生長階段。第三階段為穩(wěn)定期，培養(yǎng)時間為6～10 d，菌株的菌絲干重、OD650 nm、pH變化平緩，菌株生長處于穩(wěn)定階段。
3小結與討論
2株生防菌株在培養(yǎng)過程中，發(fā)酵液的顏色、菌絲干重、OD650 nm和pH都會隨著培養(yǎng)時間而變化。在相同的培養(yǎng)條件下，來源于不同寄主的2株生防菌株在培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液顏色不同，同一菌株生長過程中發(fā)酵液顏色會發(fā)生階段性變化，與其生理特性有關，也是菌株培養(yǎng)特征之一。2株菌株培養(yǎng)過程中OD650 nm隨培養(yǎng)進程的變化而變化，在發(fā)酵期間出現(xiàn)峰值，而且峰值出現(xiàn)的時間不同。OD650 nm為生防菌株生長過程中的生理變化特征之一。生防菌株在培養(yǎng)過程中色素變化和OD650 nm的變化可作為生防菌株培養(yǎng)的表征性特征。這些性狀的變化與生防菌的萌發(fā)、侵染以及傳播等生物學特性的關系有待于進一步的研究。
2株生防菌株培養(yǎng)過程中pH增高，從最初6左右升高到后期的8.34和9.04，2株生防菌株培養(yǎng)程中pH變化差異較大。2株生防菌株在培養(yǎng)過程中，菌絲干重隨時間變化而變化，菌絲干重增加量最大的時間分別為2～4 d和5～8 d，而且菌絲干重增加的量存在較大差異。
在培養(yǎng)溫度（25±1）℃條件下，HZ-31菌株在培養(yǎng)時間4 d時，菌絲干重最大，為834.4 mg/100 mL，pH為7.71；GD-2菌株在培養(yǎng)到8 d時菌絲干重達到最大值，為499.8 mg/100 mL，pH為7.38，說明2株生防菌株對pH有一定的選擇性，表現(xiàn)為均偏好偏堿性的生長條件。
采用PSA液體培養(yǎng)基在（25±1）℃的條件下，來自野燕麥的GD-2菌株的生長分為3個階段：1～2 d為適應階段，菌株的菌絲干重、OD650 nm、pH變化較小；3～5 d為對數(shù)生長階段，菌株的菌絲干重、OD650 nm、pH變化大；6～10 d為穩(wěn)定階段，菌株的菌絲干重、OD650 nm、pH變化平緩。而菌株HZ-31的前期生長速度高于GD-2菌株，對數(shù)生長期提前到來，這可能與菌株的生物學特性和對培養(yǎng)基的適應性有關，這與前人研究結果基本一致[3-6]，因此，在進行生防菌的發(fā)酵培養(yǎng)過程中，需注意在對數(shù)生長階段的營養(yǎng)供給和培養(yǎng)條件的控制。
研究2株生防菌株的生長特性，對生防菌株的發(fā)酵培養(yǎng)具有較好的指導作用，在實際的發(fā)酵培養(yǎng)基配方及田間應用方面，還存在著復雜的影響因素，需要進一步研究。
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