微生物生長曲線監測系統檢測抗生素體外動態抗菌作用的潛力
在革蘭氏陰性菌出現耐藥性的時代，越來越需要體外數據來支持抗生素治療的臨床證據不足。時間殺滅實驗和中空纖維感染模型通常用于預測細菌殺滅和耐藥性發展的最佳抗生素方案。盡管體外研究結果的臨床相關性尚未完全確定，但這些結果對于指導選擇要在體內進一步評估的物質和劑量方案很有價值。然而這些方法是相當勞動密集型的并且對于大量抗生素的評價是不可行的。能夠對多種抗生素方案進行高通量篩選的其他方法在尋找有效對抗多重耐藥菌株的療法方面將是有價值的。已經開發了許多用于快速評估抗生素活性的自動化方法。這些方法中的大多數提供了關于實驗過程中細菌殺死和生長動態的有限信息。Bioscreen C基于濁度測量已用于研究以連續監測細菌生長。然而這種方法需要高細菌接種量來檢測光密度(OD)的變化以及與每毫升菌落形成單位(CFU)的相關性，如活菌計數確定的那樣是不確定的。本研究旨在評估oCelloScope微生物動態監測系統檢測抗生素體外動態抗菌作用的潛力。將兩種大腸桿菌和一種銅綠假單胞菌菌株暴露于環丙沙星、粘菌素、厄他培南或美羅培南，代表具有不同作用機制的三種抗生素類別。將使用oCelloScope獲得的數據與Bioscreen C的結果進行比較，并且之前使用相同的設置和在選定時間點通過活菌計數獲得的細菌濃度進行了標準時間殺滅實驗。
丹麥Biosense微生物生長曲線監測系統的應用
細菌生長曲線是通過延時成像和oCelloScope系統的BCA算法分析生成的。首先將抗生素原液裝入清除平底96孔微孔板，在37°C下預熱約15分鐘，然后用起始培養物接種以達到每孔總體積為250μL。在將微孔板放入oCelloScope之前，用高度透明的qPCR膜覆蓋微孔板。為了盡量減少溫度波動，oCelloScope儀器被放置在Thermo Scientific Heratherm培養箱中，設置為37°C。使用底部搜索選項確定每個孔的最佳焦點。對于每個孔，每15分鐘拍攝五張圖像，持續24小時，圖像之間的距離為4.9μm，掃描長度為180μm。所有實驗一式三份進行。來自oCelloScope實驗的圖像使用生長動力學分析算法進行分析：BCA（以前稱為像素直方圖求和或PHS）和SESA算法。BCA算法通過首先校正背景強度以產生具有均勻光分布的圖像來檢測細菌生長，然后計算閾值像素值以將圖像像素分為背景像素和對象像素。然后根據對象像素數量的變化計算細菌生長曲線。
結論
近些年已經開發了許多用于快速評估抗生素活性的自動化方法。這些方法中的大多數提供了關于實驗過程中細菌殺死和生長動態的有限信息。例如Bioscreen C是基于濁度測量，已用于研究以連續監測細菌生長。然而這種方法需要高細菌接種量來檢測光密度(OD)的變化以及與每毫升菌落形成單位(CFU)的相關性，如活菌計數確定的那樣，測試得到的數值是不確定的。最近開發的一個系統，oCelloScope基于數字延時顯微鏡和圖像分析，也被提議用于測量實時細菌生長。使用這種方法，每個時間點的圖像都使用選定的算法同時處理例如，背景校正吸收（BCA）和表面積的分割和提取（SESA）。oCelloScope微生物動態監測系統用于研究暴露于-內酰胺抗生素和環丙沙星時大腸桿菌的細菌形態，以及暴露于丙酸時青霉菌的細菌形態。oCelloScope微生物動態監測系統具有有效評估抗菌活性的潛力，可用于抗生素的高通量篩選，單獨或與其他藥物聯合使用。研究發現與Bioscreen C相比，oCelloScope微生物動態監測系統提供了關于105至107 CFU/mL范圍內的細菌生長動態和形態特征的額外信息。總之oCelloScope微生物動態監測系統非常適合于抗生素體外效果的檢測，特別是在需要檢測大量方案的情況下。
圖1、大腸桿菌DA14781暴露于厄他培南1、2、4和16×MIC，大腸桿菌DA19482暴露于環丙沙星，從oCelloScope(A)、Bioscreen C(B)和標準時間殺滅實驗(C)獲得的平均細菌生長曲線0.5、1、2和4×MIC和粘菌素0.25、0.5、1、2和8×MIC和銅綠假單胞菌ATCC 27853暴露于粘菌素0.5、1、2和4×MIC和美羅培南1、2、4和16×麥克風。每條線代表不同的抗生素濃度，如圖例所示。(C)中的符號代表實驗中使用的采樣時間，黑色虛線代表檢測限為10 CFU/毫升。
圖2、從oCelloScope微生物動態監測系統顯示示出的細胞形態所獲得的圖像。大腸桿菌DA14781用厄他培南（A）DA14781，大腸桿菌DA19482和環丙沙星（B）和多粘菌素E（C），和銅綠假單胞菌ATCC 27853與粘菌素（D）和美羅培南（E)在0、2、4和24小時。
圖3、從oCelloScope獲得的背景校正吸收(BCA)與通過大腸桿菌DA14781（空心方塊）和DA19482（實心菱形）、銅綠假單胞菌ATCC 27853（空心圓圈）和空白（灰色填充）的活菌計數獲得的細菌濃度之間的一致性三角形）。在添加抗生素后1、4、6和24小時。黑色虛線代表10 CFU/mL的檢測限。低于LOD的數據繪制為5 CFU/mL。空白樣品的細菌濃度設置為0 CFU/mL。
圖4、通過的活菌計數獲得從BIOSCREEN C中獲得的光密度（OD）和細菌濃度之間相關性，大腸桿菌DA14781（空心方塊）和DA19482（實心菱形），銅綠假單胞菌ATCC 27853（空心圓）和空白（灰色填充的三角形），在添加抗生素后1、4、6和24小時。黑色虛線代表10 CFU/mL的檢測限。低于LOD的數據繪制為5 CFU/mL。空白樣品的細菌濃度設置為0 CFU/mL。
圖5、oCelloScope、Bioscreen C和標準時間消殺方法的量化方法、優點和局限性總結。如表1中總結的，標準時間殺死實驗可以提供關于實驗期間初始細菌殺死的更詳細信息。此外，由于工作量較大，時間消散是一種更靈敏的檢測耐藥性出現的方法。然而與時間消磨方法相比，自動化方法的勞動密集度較低，并且每天的產能要高得多。oCelloScope系統可以提供比Bioscreen C更多的信息，因為它具有較低的LOD，還可以用于在實驗過程中視覺檢測形態特征。
總結
近些年已經開發了許多用于快速評估抗生素活性的自動化方法。這些方法中的大多數提供了關于實驗過程中細菌殺死和生長動態的有限信息。例如Bioscreen C是基于濁度測量，已用于研究以連續監測細菌生長。然而這種方法需要高細菌接種量來檢測光密度(OD)的變化以及與每毫升菌落形成單位(CFU)的相關性，如活菌計數確定的那樣，測試得到的數值是不確定的。最近開發的一個系統，oCelloScope基于數字延時顯微鏡和圖像分析，也被提議用于測量實時細菌生長。使用這種方法，每個時間點的圖像都使用選定的算法同時處理例如，背景校正吸收（BCA）和表面積的分割和提取（SESA）。oCelloScope微生物動態監測系統用于研究暴露于-內酰胺抗生素和環丙沙星時大腸桿菌的細菌形態，以及暴露于丙酸時青霉菌的細菌形態。oCelloScope微生物動態監測系統具有有效評估抗菌活性的潛力，可用于抗生素的高通量篩選，單獨或與其他藥物聯合使用。研究發現與Bioscreen C相比，oCelloScope微生物動態監測系統提供了關于105至107 CFU/mL范圍內的細菌生長動態和形態特征的額外信息。總之oCelloScope微生物動態監測系統非常適合于抗生素體外效果的檢測，特別是在需要檢測大量方案的情況下。
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