食品微生物檢驗：菌落總數檢測結果不確定度的評定
食品微生物檢驗對評價食品衛生質量、監督食品安全有著尤為重要的作用，其結果的準確性影響結果報告的判定。菌落總數定義為食品樣品經過處理，在合理的培養條件下培養后，每克或每毫升食品檢樣中所生長出來的的微生物菌落總數。菌落總數是評價食品污染程度、儲存期以及安全性的衛生指示菌。《檢測和校準實驗室能力認可準則》（ISO/IEC 17025：2017）中明確指出實驗室應具備對測量結果進行不確定度評定的能力。《檢測和校準實驗室能力認可準則在微生物檢測領域的應用說明》（CNAS-CL01-A001）也指出在微生物檢測中需要對不確定度做出合理評估。不確定度評定是評定結果可靠性的有效方法。
研究按照《測量不確定度的要求》（CNAS-CL01-G003）和JJF1059.1—2012[6]、GB/T 27418—2017對微生物檢驗中菌落總數的檢測結果作不確定度評定。對菌落總數測定結果進行不確定度評定是質量控制的一部分，對于數據的可靠性、結果的符合性判定具有重要意義。
1材料與檢測方法
1.1測試樣品
本測量不確定度評定實例為單一樣品的重復測量，測試樣品為月餅。《月餅》（GB/T 19855—2015）[9]對菌落總數做出的要求為符合《食品安全國家標準糕點、面包》（GB 7099—2015）[10]，最高限量為104CFU/g，所以實驗稀釋度取10-1與10-2。
1.2材料與設備
平板計數瓊脂（250 g，青島海博生物技術有限公司）；B級潔凈實驗室；高壓蒸汽滅菌器（MSL.N，山東威高集團）；凈化工作臺（SJ-CJ-2FD，蘇州蘇潔）；生化培養箱（SPX-250B-Z，上海博訊）。
1.3實驗方法
1.3.1檢測依據
《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》（GB 4789.2—2016）[1]。
1.3.2檢測過程
（1）無菌操作稱取25 g月餅于均質袋中，加入225 mL生理鹽水進行均質，轉速8 000～10 000 r/min，時間2 min，制成10-1樣品勻液。
（2）吸取1 mL上述樣品勻液，沿試管壁加入1支無菌試管中（含9 mL生理鹽水），充分混勻，制成10-2樣品勻液。
（3）稀釋時在無菌平皿內加入1 mL樣品勻液（2個平行），同時用無菌生理鹽水做空白對照。
（4）每皿傾注20 mL平板計數瓊脂培養基（46℃左右），轉動平皿，使培養基與樣液混合均勻。
（5）平板凝固后，倒置培養，溫度（36±1）℃，時間（48±2）h。
（6）結果觀察并計算。菌落計數范圍30～300 CFU/g。
2數學模型
（1）只有一個稀釋度（10-3）的菌落在可計數范圍，則，，例d=10-3。
（2）2個連續稀釋度（如10-2、10-3）的菌落在可計數范圍，則為：
式中：N檢樣中菌落總數，CFU/g；∑C平板菌落總數的和，CFU/g；n1低稀釋倍數平板個數；n2高稀釋倍數平板個數；d-稀釋因子（第一稀釋度），例d=10-2。
3不確定度的評定
菌落總數檢測的特點是數據結果的發散性很大，不是正態分布，而屬于偏態分布，因此直接通過結果平均值的計算，得到標準偏差的方法顯得不太合理。所以通常的做法是將結果取對數后，再用常規的貝塞爾方法進行計算。
不確定度測量除各種系統因素的影響外，還包括隨機因素的影響[14]。微生物檢測不確定度一般來源于培養基、培養條件、計量器具校準及操作人員技能等。本研究對B類不確定度（樣品處理、稀釋、加樣體積）及A類不確定度（重復操作）進行分析，見表1。
表1不確定度匯總表
3.1標準不確定度估算
3.1.1樣品處理相對標準不確定度（urel（制備））
制備10-1樣品勻液，主要涉及稱取樣品時電子秤（使用1次）的相對標準不確定度和量取生理鹽水時量筒（使用1次）的相對標準不確定度。
根據天平制造商的說明書，該天平的分辨力d=0.1 g，區間半寬度為0.05 g，按矩形分布，按照樣品稱量取25.0 g；根據《常用玻璃量器檢定規程》（JJG 196—2006）得知250 mL量筒容量允許誤差為±2.0 mL，取矩形分布。則樣品稱量引入的相對標準不確定度分量為：
3.1.2遞增稀釋相對標準不確定度（urel（稀釋））
在制備樣品勻液時，主要由1 mL和10 mL移液器引入的不確定度，1 000μL和10 000μL移液器的容量允許誤差[18]分別為±10μL和±60μL，其中10 mL和1 mL移液器各用了1次。
3.1.3加樣體積相對標準不確定度（urel（加樣））
吸取1 mL樣品勻液于無菌平皿內，做2個平行，使用1 000μL移液器2次。加樣時相對標準不確定度為：
3.1.4 A類重復測量引起的不確定度（urel（A））
按照試驗方法對樣品平行測定10次，檢測數據見表2。具體計算如下。
表2單一樣品重復測量的計算過程
（1）每次測量結果均值xi。
（2）取對數lgxi，計算平均值
（4）數據結果為10次重復操作的平均值，則為：
3.2相對合成標準不確定度及擴展不確定度
引起不確定度分量都是相對獨立的，則合成不確定度為：
依據標準《化學分析測量不確定度評定》（JJF 1135—2005）[19]，由于置信概率p=95%，自由度v=10-1=9，由t分布表可得
3.3取反對數，由lgx坐標回到x坐標
由于lgx與x的非線性關系，不能直接求擴展不確定度U的反對數[20]，只能給出微生物含量的可能區間。因此確定lgx的取值范圍為：lgx=3.542 3±0.149 2，即lgx的取值為3.393 1～3.691 5，再取反對數后可得2.5×103CFU/g≤x≤4.9×103CFU/g。
4僅A類重復測量引起的不確定度
在評定不確定度時，不考慮B類各種隨機影響引入的不確定度分量。10次重復測量的平均值的標準不確定度為：
由于置信概率p=95%，自由度v=10-1=9，由t分布表可得k=2。
5結論
從不確定度計算結果可以看出，4種因素對測量結果均有影響，經計算得出，這些分量可以忽略不計。B類不確定度分量對合成不確定度影響較小，A類重復測量帶來的不確定度分量最大，所以主要考慮重復操作引起的不確定度，即統計的A類評定測量不確定度是可行的。按照此方法進行菌落總數的不確定度評定，可減少誤差，提高結果精確度，對測量指標合格與否提供理論依據和指導。
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