北京及非北京基因型結(jié)核分枝桿菌的生長曲線與基因表達差異
1995年，在中國北京及周邊地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)并報道MTB北京基因型菌株，將其命名北京型菌株。全球MTB臨床分離株的13%是北京基因型菌株，并導致了全世界1/3的TB。與非北京基因型菌株相比，北京基因型菌株具有一定的選擇優(yōu)勢，傳播速度更快，毒力更強，往往更加致命。究竟什么原因賦予北京基因型菌株的這些特點還不完全清楚，被認為是相關特定分子的內(nèi)在表達變化所決定。
研究結(jié)果顯示，北京和非北京基因型菌株其生長曲線總體趨勢都是標準條件下的OD值高于低氧及營養(yǎng)饑餓條件，正常標準培養(yǎng)條件下，由于氧氣、營養(yǎng)充足、充分，適合MTB生長繁殖，OD值高；低氧條件下OD值低，MTB生長輕度受限，這種不利條件也是促進MTB持留生存的因素之一；營養(yǎng)饑餓條件下OD值最低，說明MTB生長速度最慢，繁殖速度降低以利于存活，也許這與MTB入侵人體被巨噬細胞吞噬后不被清除變?yōu)樾菝呔鷻C制相一致。與非北京基因型菌株相比，北京基因型菌株在低氧、營養(yǎng)饑餓的條件下OD值均高，即在不利條件下，北京基因型菌株生長繁殖速度快于非北京基因型菌株，說明其對低氧、營養(yǎng)饑餓不利條件耐受性較好，在壓力條件下生存能力強，這也許是北京基因型菌株易流行的原因之一。是MTB什么內(nèi)在的因素造成了這種不同，作者初步探索了MTB菌株的毒素-抗毒素mazEF系統(tǒng)與其生長繁殖的相關性。
毒素-抗毒素(TAS)由毒素蛋白和同源的抗毒素組成，mazEFTAS能夠促進程序性細胞死亡，抑制細菌生長，誘導持留菌的形成，造成潛伏感染及提高細菌對環(huán)境壓力的耐受性。TAS的作用機制取決于病原菌在不同生活時期的生物學特性，當受到不良環(huán)境或刺激后，打破了毒素抗毒素之間的平衡，抵抗力強的毒素被激活，作用于胞內(nèi)靶分子，引起抑菌或殺菌效應。
Sat等對大腸桿菌進行mazEF基因敲除，通過比較其普通菌株和敲除株對不利環(huán)境如藥物的反應，發(fā)現(xiàn)藥物可以干擾或消耗不穩(wěn)定的抗毒素，而使穩(wěn)定的毒素MazF堆積，導致細菌的程序性死亡，因此推測mazEF可能是其程序性死亡進程中的關鍵因素。本研究通過敲除和過表達北京和非北京基因型菌株mazEF3、mazEF6和mazEF9基因后，觀察各菌株在不同環(huán)境下的生長曲線，結(jié)果顯示無論是北京還是非北京基因型菌株，其缺失突變株和過表達菌株的OD值均低于親本株，提示mazEF3,6,9與MTB生長繁殖相關。缺失后，mazEF3,6,9不能發(fā)揮其應有的調(diào)節(jié)細菌生長繁殖作用，尤其是在不利的環(huán)境條件下，導致MTB菌數(shù)下降。過表達mazEF3、mazEF6和mazEF9基因，MTB菌數(shù)也降低，推測雖然抗毒素可以中和毒素，但是抗毒素不穩(wěn)定，易降解，導致毒素增多、引起菌體死亡，或者是由于菌體內(nèi)其他調(diào)節(jié)因素也參與了對其過表達調(diào)節(jié)作用的結(jié)果。究竟是何種原因?qū)е碌倪@種現(xiàn)象，需要進一步探討。該結(jié)果也提示作者應進一步研究：在上述培養(yǎng)條件下，分別檢測mazE3、mazE6、mazE9、mazF3、mazF6和mazF9對北京和非北京基因型菌株生長繁殖的影響。在mazEF系統(tǒng)mRNA表達水平上，北京基因型與非北京基因型菌株相比，mazEF3高表達；mazF3、mazF6、mazF9均高表達；mazE9低表達，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
注：a. 北京基因型菌株及其缺失和過表達菌株在不同培養(yǎng)條件下的生長曲線；b. 非北京基因型菌株及其缺失和過表達菌株在不同培養(yǎng)條件下的生長曲線。圖2 結(jié)核分枝桿菌及其mazEF3,6,9基因缺失和過表達菌株的生長曲線
有研究表明，分枝桿菌中Rv1103c-1102c(mazEF3)、Rv1991a-1991c(mazEF6)和Rv2801a-2801c(mazEF9)屬于經(jīng)典的TAS，其中mazEF6、mazEF9在營養(yǎng)匱乏環(huán)境中啟動子增強最顯著。本研究結(jié)果顯示北京基因型比非北京基因型菌株的mazEF3基因轉(zhuǎn)錄水平高，兩者同為臨床致病菌，或許mazEF3高表達賦予了北京基因型菌株抗壓力強的特點，在入侵宿主時可以抵抗機體的不利環(huán)境而生存，這也許是造成其易流行、持留生存及出現(xiàn)耐藥菌性的原因之一。當MTB處于不利環(huán)境時或入侵宿主遭遇免疫系統(tǒng)攻擊時，接受細胞外死亡因子的刺激，細菌的TAS被激活，其中毒素性質(zhì)穩(wěn)定，而抗毒素性質(zhì)不穩(wěn)定易被蛋白水解酶水解，造成毒素累積，而北京基因型菌株毒素基因均高表達，可產(chǎn)生更多的毒素，可以選擇性的使一些細菌死亡，從而為剩余的細菌保留能量和營養(yǎng)物質(zhì)，此為利他性死亡，以保證群體穩(wěn)態(tài)和適應不利環(huán)境。
作為新疆主要流行株北京基因型菌株mazE9低表達，推測為是內(nèi)在特定分子表達調(diào)節(jié)的結(jié)果，尤其是mazE9低表達和mazF9高表達的協(xié)同作用，能使更多的毒素累積進行利他性程序性死亡，從而提高自身對不良環(huán)境的耐受性，也許這也是成為流行株的原因之一。
研究證實大量誘導表達MazF可使細胞處于停滯狀態(tài)，隨后大劑量誘導表達MazE可中和MazF的毒性，使細胞恢復活性。這一停滯狀體與結(jié)核分枝桿菌的休眠狀態(tài)很相似。當游離的MazF在細胞內(nèi)時間或累計量超過某一界點時，就會導致細胞的死亡。我們推測毒素蛋白累積量不同可以使細胞表現(xiàn)出不同的狀態(tài)，當少量累計時提高細胞對不利生存環(huán)境的耐受，當環(huán)境進一步惡化，毒素持續(xù)累積，促使細胞進入休眠狀態(tài)，當毒素作用時間或者累積量達到某一值時細胞死亡。實驗中使用Western Blot技術檢測蛋白質(zhì)水平的表達時，結(jié)果顯示，北京基因型菌株相對于非北京基因型菌株，MazF9蛋白高表達，與mazF9基因mRNA表達趨勢一致。在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上，mazF9的高表達也許是北京基因型菌株成為流行株、廣泛傳播的原因之一。
綜上所述，作者初步探索了北京及非北京基因型結(jié)核分枝桿菌的生長曲線、mazEF3,6,9系統(tǒng)表達有無差異以及mazEF系統(tǒng)是否與北京基因型菌株流行相關。研究結(jié)果表明，北京與非北京基因型結(jié)核分枝桿菌的生長曲線、mazEF3,6,9系統(tǒng)表達存在差異，mazEF系統(tǒng)與北京基因型菌株流行相關。MTB的染色體上存在著大量的TAS系統(tǒng)，mazEF3,6,9系統(tǒng)只是其中之一，mazEF3,6,9系統(tǒng)在MTB中究竟如何發(fā)揮作用以及與其他TAS系統(tǒng)、調(diào)節(jié)因素的互作用需要進一步研究。
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