枯草芽孢桿菌BC80-6發酵培養基、生長條件及對煙草根黑腐病菌生防作用（二）
2、結果與分析
2.1、處理液對煙草根黑腐病菌菌絲生長及孢子萌發的影響
由表1可知，3種枯草芽孢桿菌BC80-6處理液對煙草根黑腐病菌菌絲的生長均具有抑制作用。隨著處理液稀釋倍數的增加，其對BC80-6菌絲生長的抑制率逐漸減小。其中，活菌液的抑制效果最好，10-1倍的活菌液對BC80-6菌絲生長的抑制率為93.20%。10-1倍的過濾液和高溫滅菌液對BC80-6菌絲生長的抑制率分別為74.9%、7.4%，高溫滅菌液抑制效果最差。
表1不同處理液對煙草根黑腐病菌的抑制作用
3種枯草芽孢桿菌BC80-6處理液對煙草根黑腐病菌孢子的萌發均具有抑制作用（表1）。其中，活菌液和過濾液對煙草根黑腐病菌孢子的萌發均具有較好的抑制作用，10-1倍的活菌液和過濾液對孢子萌發的抑制率分別為95.3%、93.4%。隨稀釋倍數的增加，活菌液和過濾液對孢子萌發的抑制率逐漸降低，且不同稀釋倍數之間差異顯著。滅菌液的抑制效果最差，10-1、10-2、5×10-2倍的滅菌液對孢子萌發的抑制率為30.3%、3.8%和2.4%。
2.2、培養基成分的優化
2.2.1碳源的優化
由圖1可知，菌株BC80-6在不同碳源培養基中均可生長。其中，在蔗糖為碳源的培養基中，菌株BC80-6的活菌含量最高，為1.58×109 cfu·mL-1；葡萄糖和乳糖次之，其活菌含量分別為1.42×109和1.39×109 cfu·mL-1。因此，菌株BC80-6生長的最佳碳源是蔗糖，其次是葡萄糖。
圖1碳源對枯草芽孢桿菌生長的影響
2.2.2氮源的優化
由圖2可知，氮源為有機氮時菌株BC80-6的生長明顯優于無機氮。以無機氮（尿素、氯化銨）為氮源，菌株BC80-6的活菌含量較少（<0.28×109 cfu·mL-1），說明菌株BC80-6不能很好地利用這兩種氮源。以有機氮（酵母浸出物、牛肉膏、蛋白胨和大豆蛋白胨）為氮源，菌株BC80-6的活菌含量均高于1.2×109 cfu·mL-1。菌株BC80-6生長的最適氮源是酵母浸出物，活菌含量為1.95×109 cfu·mL-1。
圖2氮源對枯草芽孢桿菌生長的影響
2.2.3無機鹽的優化
由圖3可知，菌株BC80-6在無機鹽為MgSO4、CaCl2、NaCl2的培養基中生長較好，活菌含量較多，分別為1.98×109、1.54×109和1.52×109 cfu·mL-1。菌株BC80-6不適合在含FeSO4的培養基中生長，活菌含量僅為0.62×109 cfu·mL-1，遠小于CK（1.4×109 cfu·mL-1）的活菌含量。因此，菌株BC80-6在無機鹽為MgSO4的培養基中生長最好。
圖3無機鹽對枯草芽孢桿菌生長的影響
2.3、碳源、氮源、無機鹽3因素的正交優化
由2.2節結果可知，最佳碳源、氮源、無機鹽的種類分別是：蔗糖、酵母浸出物、MgSO4。蔗糖、酵母浸出物、MgSO4各設3個含量水平，進行正交試驗（表2）。
表2正交試驗因素和水平編碼
正交試驗結果（表3）表明：當培養基中的酵母浸出物、蔗糖、MgSO4含量分別為0.5%、1.5%、0.06%時，菌株BC80-6的活菌含量最高，即最適合菌株BC80-6的生長。R值能反應3種因子對活菌含量影響的大小，R值越大，則該因子的影響越大。RA>RB>RC，即酵母浸出物含量對菌株BC80-6生長的影響最大，為主要因子，蔗糖含量其次，MgSO4影響最小。
表3 L9（33）正交試驗結果①
注：①K1、K2、K3分別代表各因素1、2、3水平的3次活菌含量之和；k1、k2、k3分別代表對應K的平均值；R代表極差值，即各因素各水平下k值對應的最大值與最小值之差。
F檢驗結果（表4）表明：酵母浸出物的F值最大，為110.789（>F0.01），呈極顯著差異，是主要影響因素。蔗糖的F值介于F0.01與F0.05之間，呈顯著差異。硫酸鎂的F值<F0.05，對菌株BC80-6生長的影響較小。
表4正交試驗的方差分析
2.4、發酵條件的優化
2.4.1生長曲線的測定
由圖4可知，0~3 h為菌株BC80-6的生長停滯期，活菌含量增長較少。3 h后菌株BC80-6生長較快，活菌含量大幅增加。9~24 h，菌株BC80-6生長穩定，活菌含量增長緩慢。24 h活菌含量達到最大，為2.5×109 cfu/mL。24 h后活菌含量開始減少，菌株BC80-6進入生長衰亡期。因此，選用培養9~24 h的菌液為菌種較合適，此時菌株BC80-6在對數生長末期，既有較高的細胞活力，又可獲得較多的細胞數。
圖4枯草芽孢桿菌BC80-6的生長曲線
2.4.2培養溫度的優化
由圖5可知，菌株BC80-6適宜在25~28℃生長。在28℃時，其發酵液里活菌含量最多，為2.52×109 cfu/mL。因此，28℃是菌株BC80-6的最適培養溫度。
圖5溫度對枯草芽孢桿菌BC80-6生長的影響
2.4.3培養液初始pH的優化
由圖6可知，當pH在5.5~6.5之間，菌株BC80-6的活菌含量隨pH的增大而增大。當pH為6.5時，活菌含量達到最大，為2.44×109 cfu/mL。當pH在6.5~8.0之間，隨著pH的增大，菌株BC80-6的活菌含量明顯下降。因此，培養液的pH應控制在6.5左右。
圖6 pH對枯草芽孢桿菌BC80-6生長的影響
2.4.4接種量的優化
當接種量為5%時，菌株BC80-6的活菌含量最多，為2.48×109 cfu/mL。因此，5%的接種量為最適接種量。
2.4.5轉速的優化
轉速從120 r/min增加至180 r/min時，菌株BC80-6的活菌含量逐漸增加，轉速從180 r/min增加至220 r/min時，活菌含量逐漸減少。轉速為180 r/min時，菌株BC80-6的活菌含量最多，為2.48×109 cfu/mL，表明轉速影響菌株BC80-6的生長。因此，菌株BC80-6的最佳轉速為180 r/min。
2.4.6裝液量的優化
裝液量不同，菌株BC80-6的活性不同。當250 mL三角瓶的裝液量在20~40 mL之間時，菌株BC80-6的活菌含量隨裝液量的增加而增加。當250 mL三角瓶的裝液量大于40 mL時，活菌含量隨裝液量的增加而下降。裝液量為40 mL時，菌株BC80-6的活菌含量最多，為2.46×109 cfu/mL。因此，搖床培養時，250 mL三角瓶的最佳裝液量為40 mL。
2.5枯草芽孢桿菌BC80-6對煙草根黑腐病的田間防控效果
大多數對照組煙苗出現明顯的根黑腐病癥狀，煙苗根系出現黑色腐爛，植株明顯矮化，葉片萎蔫，長勢較差。菌株BC80-6處理的煙苗地上部分較少出現萎蔫癥狀，長勢較好，根部正常。由表5可知，菌株BC80-6處理的煙株發病率和病情指數顯著低于對照組，大田防治效果達88.19%。與生產上使用的化學藥劑（多菌靈和甲基托布津）防治效果差異不大。
3、討論
枯草芽孢桿菌可通過產生抗菌物質來抑制病原菌的生長。本研究中，枯草芽孢桿菌BC80-6的過濾液和滅菌液對煙草根黑腐病菌的菌絲和孢子有一定抑制作用，表明菌株BC80-6可產生某些抗菌物質來抑制煙草根黑腐病菌的生長。菌株BC80-6活菌液對煙草根黑腐病菌菌絲和孢子的抑制效果最好，可能是由于菌株BC80-6不斷繁殖產生更多抗菌物質，或與病原菌不斷爭奪營養，從而有效地抑制病原真菌生長。
通過發酵試驗對菌株BC80-6培養基的配方及培養條件進行優化，結果表明培養條件的不同，碳氮無機鹽及其含量的不同對菌株BC80-6的活菌含量影響很大。優化后的菌株BC80-6培養基成分及其含量與已報道的培養基成分具有差異，可能跟不同菌株的生活環境不同、所需要的營養成分也不同有關。不同細菌的寄居環境不同，因而其最佳發酵條件也不同。優化后的培養基成分較少、價格相對較低，而且是生產上較容易獲得的化工原料，因而在工業化發酵生產中有一定的優勢。
在溫室中測定了芽孢桿菌對煙草根黑腐病菌的控病試驗，發現芽孢桿菌的防效為80.2%，與對照藥劑多菌靈和甲基托布津的處理效果無明顯差異。本試驗中，菌株BC80-6對煙草根黑腐病的大田防效為88.19%，接近生產上使用的多菌靈和甲基托布津（分別為92.21%、89.66%）的防效。表明芽孢桿菌具有較好的生物防治能力，可用于煙草根黑腐病的生物防治。
4、結論
①在3種枯草芽孢桿菌BC80-6處理液對煙草根黑腐病菌菌絲生長、孢子萌發的抑制試驗中，抑制效果最好的是10-1倍活菌液。②1.5%蔗糖、0.5%酵母浸出物、0.06%硫酸鎂（質量體積比）是培養菌株BC80-6的最佳培養基配方。③在時間24 h、溫度28℃、初始pH 6.5、搖床轉速180 r/min、接種量5%、250 mL三角瓶裝液量40 mL的條件下，最有利于菌株BC80-6的發酵。④菌株BC80-6活菌液對煙草根黑腐病的大田防效達88.19%。
枯草芽孢桿菌BC80-6發酵培養基、生長條件及對煙草根黑腐病菌生防作用（一）
枯草芽孢桿菌BC80-6發酵培養基、生長條件及對煙草根黑腐病菌生防作用（二）