納米銀的制備方法及對(duì)小麥赤霉病菌抗菌活性的影響（一）
采用化學(xué)還原法制備納米銀，以小麥赤霉病菌為受試菌株，研究納米銀對(duì)小麥赤霉病菌抗菌活性、對(duì)細(xì)胞內(nèi)3種保護(hù)酶：超氧化物歧化酶 (SOD)、過氧化物酶 (POD)、過氧化氫酶 (CAT) 活性和對(duì)細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)：丙二醛 (MDA)、可溶性蛋白、可溶性糖含量的影響。結(jié)果表明：納米銀能顯著抑制小麥赤霉病菌的生長，抑制作用隨著濃度的增加而不斷增大，10μg/mL的納米銀對(duì)病原菌的抑制率達(dá)90%以上，有效中濃度 (50) 為0.59 μg/mL。隨著納米銀處理時(shí)間 (2、4、6、8和10 h) 的增長，3種酶的活性均出現(xiàn)先增加后降低的變化。SOD、POD和CAT均在4 h出現(xiàn)最高值，10 h降至最低。納米銀使得菌體內(nèi)丙二醛含量增加，可溶性蛋白和可溶性糖含量降低。納米銀破壞了病原真菌體內(nèi)細(xì)胞的完整性，這可能是納米銀抑制病原菌生長的機(jī)理之一。
小麥赤霉病，是由禾谷鐮孢菌引起的病害，主要發(fā)生在亞洲地區(qū)，是小麥生產(chǎn)的重要病害之一。小麥感染赤霉病后，會(huì)產(chǎn)生單端孢霉烯真菌毒素，從而導(dǎo)致小麥減產(chǎn)以及品質(zhì)下降，不適合人類和動(dòng)物的食用。中國作為世界小麥生產(chǎn)大國，小麥赤霉病發(fā)生頻率非常高，受小麥赤霉病的影響也很大。納米銀是一種無機(jī)抗菌材料，有研究表明，納米銀對(duì)細(xì)菌、真菌及支原體等致病微生物的生長具有抑制作用，對(duì)某些病毒和原生動(dòng)物也具有很強(qiáng)的殺傷力，同時(shí)不產(chǎn)生耐藥性，可以作為一種長效且安全性高的抑菌劑。Mishra和Singh研究了納米銀對(duì)小麥根腐病菌的抗真菌活性，結(jié)果表明納米銀能顯著抑制的菌絲生長。0.05 mg/mL的納米銀能明顯抑制菌絲生長，0.1 mg/mL的納米銀能完全抑制病原體。Muthuramalingam等研究了膽汁鹽修飾的納米銀對(duì)炭疽病有很好的抑制效果。此外，納米銀還能夠抑制黃瓜和南瓜白粉病 菌、番茄丁香假單胞菌、草莓灰霉病菌、黑曲霉、溫特曲霉等病原菌。盡管大量的實(shí)驗(yàn)表明，納米銀對(duì)細(xì)菌和真菌均具有顯著的抑制作用，但是納米銀對(duì)真菌具體的殺菌過程及機(jī)理還不是十分清楚。
生物體內(nèi)3種重要的保護(hù)酶：超氧化物歧化酶 (SOD)、過氧化氫酶 (CAT) 和過氧化物酶 (POD)，可以防止體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，清除超氧自由基、H2O2和過氧化物以及降低或抵制羥基自由基的生成等。尹大川等研究了木霉菌株T43及其抑菌活性物質(zhì)對(duì)4種林木病原菌的3種保護(hù)酶 (CAT、POD、SOD) 活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株T43發(fā)酵液乙酸乙酯提取物對(duì)病原菌3種保護(hù)酶活性均有不同程度的影響，可導(dǎo)致病原菌3種保護(hù)酶活性降低，尤其是SOD活性下降得最為顯著，從而破壞了細(xì)胞的完整性。
可溶性蛋白和可溶性糖作為肌體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，當(dāng)肌體受到外界壓迫時(shí)，能夠降低這種傷害。研究表明，可溶性蛋白和可溶性糖的變化可以反映細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成、變性及降解等。丙二醛 (MDA) 含量變化可以反映膜結(jié)構(gòu)的破壞程度，是反映細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化程度的重要指標(biāo)。
因此，本試驗(yàn)利用化學(xué)還原法制備納米銀，研究納米銀對(duì)小麥赤霉病菌的抗菌活性以及對(duì)菌體內(nèi)SOD、POD、CAT三種酶活性和對(duì)丙二醛、可溶性蛋白、可溶性糖含量的影響，以此來探討納米銀的抑菌機(jī)理，為納米銀抑菌應(yīng)用提供理論依據(jù)，為解決病原真菌入侵性感染和防治植物真菌病害提供參考。
1 材料與方法
1.1 供試菌株
供試菌株：小麥赤霉病菌，由中北大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供。
1.2 納米銀的制備
首先將10 mL、0.02 mol/L硝酸銀 (AgNO3) 溶液和10 mL、3%聚乙烯吡咯烷酮 (PVP) 溶液混合，然后將該混合液攪拌2 h (室溫)，最后在攪拌的同時(shí)，逐滴滴加10 mL、0.01%硼氫化鈉 (NaBH4) 溶液，制備納米銀溶膠。納米銀溶膠經(jīng)過離心、去離子水和無水乙醇洗滌數(shù)遍、真空干燥得到納米銀粉末。在NaBH4溶液的滴加過程中，反應(yīng)溶液逐漸變?yōu)榱咙S色，說明納米銀的形成。采用紫外可見分光光度計(jì)表征納米銀溶液的UV-vis吸收光譜，進(jìn)一步利用透射電子顯微鏡 (TEM) 表征納米銀的粒徑。
1.3 納米銀的抗菌活性
利用生長速率法測定納米銀的抑菌活性。具體方法如下：用馬鈴薯葡萄糖(PDA)培養(yǎng)基將納米銀稀釋成終濃度為10、5、2.5、1.25 μg/mL。取培養(yǎng)5 d的5 mm直徑的菌餅，將其輕放于含上述已配制好的不同濃度納米銀的培養(yǎng)基平板中 (有菌絲的一面朝下)。以不添加任何物質(zhì)的PDA平板作為空白對(duì)照，放入28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)3次。3 d后用十字交叉法測量病原菌的直徑，計(jì)算菌絲生長抑制率、納米銀濃度的毒力回歸方程以及50。
1.4 供試菌的處理
用打孔器取培養(yǎng)5 d、直徑5 mm的菌餅，接種到PDA液體培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)8 d，將菌絲體用蒸餾水洗滌3次，用吸水紙吸干，準(zhǔn)確稱取菌絲0.5 g，分別放入20 mL、10 μg/mL納米銀溶液浸泡2、4、6、8、10 h，過濾菌絲體，用蒸餾水洗滌3次。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，測定納米銀對(duì)小麥赤霉病菌保護(hù)酶活性、MDA含量、可溶性蛋白含量和可溶性糖含量的影響，其中用DDS-11A型電導(dǎo)儀測定電導(dǎo)率，實(shí)驗(yàn)以蒸餾水作為對(duì)照。
1.5 酶活性測定
SOD酶液制備：往已處理過的菌絲體中加入5 mL、0.05 mol/L磷酸緩沖液 (pH 7.8，含有1% PVP，0.5 mmol/L巰基乙醇和0.1 mmol/LEDTA)，冰浴研磨，于4 ℃、10 000 r/min冷凍離心15 min，得到上清液，置于4 ℃冰箱保存。SOD酶活性采用氮藍(lán)四唑法測定。
POD和CAT酶液的制備：往已處理過的菌絲體中加入5 mL、0.05 mol/L的磷酸緩沖液 (pH 7.0，含0.1 mmol/LEDTA)，冰浴研磨，4 ℃、10 000 r/min冷凍離心15 min，得到上清液，置于4 ℃冰箱保存。POD酶活性利用愈創(chuàng)木酚法測定。CAT酶活性采用紫外吸收法測定。
1.6 丙二醛 (MDA) 含量的測定
采用硫代巴比妥酸比色法測定小麥赤霉病菌中MDA含量。
1.7 可溶性蛋白含量的測定
可溶性蛋白提取：在1 g已處理過的菌絲體中加10 mL蒸餾水研磨，所得勻漿于12 000 r/min離心15 min，得上清液，定容至10 mL，得粗提液。可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測定。
1.8 可溶性糖含量的測定
可溶性糖提取：在1 g已處理過的菌絲體中加入10 mL蒸餾水，沸水浴20 min，冷卻過濾定容至25 mL容量瓶中，得粗提液。可溶性糖含量采用蒽酮比色法測定。
1.9 數(shù)據(jù)處理與分析
采用SPSS 22.0和OriginProPorable 8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。
納米銀的制備方法及對(duì)小麥赤霉病菌抗菌活性的影響（一）
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