莠去津對水稻根際土壤微生物菌群結構及降解基因豐度的影響（一）
莠去津(atrazine，ATZ)屬于三嗪類芽前、芽后除草劑，在玉米、高粱、甘蔗等作物上廣泛使用，主要防除多種一年生禾本科和闊葉雜草，具有防治效率高、成本低廉、殺草譜廣等優點，在70多個國家及地區應用廣泛。與此同時，由于莠去津遷移性較強且消解半衰期長，導致其在農田土壤、毗鄰農田的地下水及地表水中頻頻被檢出，在種植玉米后的土壤中莠去津的檢出量可達0.9 mg/kg。環境中殘留的莠去津易被植物吸收，對后茬敏感作物(水稻、小麥、甘薯等)造成藥害，嚴重影響后茬作物的生長及安全生產。據報道，按照通常用量(38%莠去津懸浮劑1.5 L/hm2)施用，莠去津對小麥的生長影響較大，可造成小麥旗葉干枯、籽粒偏小等現象；采用低濃度莠去津(0.2～0.8 mg/L)處理水稻幼苗后，水稻生長受到抑制，細胞膜通透性增強，葉綠素含量下降，同時莠去津可在水稻籽粒中積累。另外，莠去津還能通過食物鏈(如谷物等)進入人體，對動物及人類的神經系統、生殖系統及內分泌系統具有潛在的威脅。因此，降低生態環境及農作物中莠去津的殘留，對農業生產及人類健康具有重要意義。
土壤中微生物無處不在，其對土壤物質循環和農藥殘留修復起著重要作用，但殘留農藥反過來也會影響土壤微生物的多樣性及功能基因的豐度。同時，根際微生物也會影響植物對農藥的降解代謝。研究表明，根際微生物可以聯合植物提高根際土壤中農藥的降解效率，緩解殘留農藥對植物的毒害作用。Ahmad等發現，將根際降解菌群接種于雙草醚(2和5 mg/L)污染土壤，可以增強小麥對雙草醚的降解作用，降解率可高達100%；Salam等發現，在種植前將甘蔗莖稈浸泡在含假絲酵母菌酵母CandidaVITJzN04(3×105CFU/mL)的YEPD培養基中，處理5 d后種植在林丹(100 mg/kg)污染土壤中，可以顯著增強甘蔗根際林丹的降解，使其降解半衰期從43.3 d減至7.1 d。近年來，關于莠去津降解菌的篩選及應用有較多報道，同時降解菌的降解基因也已明確，包括atzA～atzF，其中模式菌株Pseudomonassp.ADP包含了所有降解基因，能將莠去津完全礦化。然而，目前關于莠去津降解菌的研究主要集中于離體條件下菌株對莠去津的降解功能探究，以及菌株在修復莠去津污染土壤中的應用，但關于莠去津降解菌在“土壤-植物”系統的修復應用報道較少，菌株對植物耐受莠去津脅迫的影響機制也尚不清楚。
本研究采用盆栽試驗模擬水稻的大田生長環境，研究了莠去津對水稻根際微生物菌群結構及降解基因豐度的影響，并從水稻根際土壤中分離純化出一株莠去津降解菌Pseudomonassp.AT2，將其應用于莠去津污染土壤，探究了AT2對“土壤-水稻”系統中莠去津降解的影響及機制，以期為保障水稻的安全生產提供一定的理論基礎。
1材料與方法
1.1供試材料
1.1.1藥劑及試劑98%莠去津(atrazine)原藥購于先正達南通作物保護有限公司，稱取0.02 g(精確到0.0001 g)莠去津原藥，用50 mL乙腈完全溶解，配制成400 mg/L的莠去津母液，于4℃保存，待用；乙腈為色譜純。無機鹽(MSM)培養基：MgSO4·7H2O 0.40 g，FeSO4·7H2O 0.20 g，K2HPO40.20 g，(NH4)2SO40.20 g，CaSO40.08 g，去離子水1 L，pH 7.0～7.2，并于121℃滅菌20 min，備用。植物總RNA提取試劑盒購于北京莊盟國際生物基因科技有限公司；反轉錄試劑盒、Green qPCR SuperMix購于北京全式金生物技術股份有限公司；引物由通用生物(安徽)股份有限公司合成。
1.1.2供試土壤采自江蘇省南京市農田(0～20 cm)，土壤類型為黃棕壤(N 35.03°；E 118.87°)，其基本理化性質為：pH 7.24，黏粒含量27%，有機質含量為24.61 g/kg，有機碳含量為7.44 g/kg。土樣去除植物根系后過2 mm不銹鋼篩網，備用。
1.2根際土壤微生物群落多樣性分析
莠去津污染土壤的制備參照程金金等的方法。取1 mL 400 mg/L的莠去津母液，采用100 mL丙酮稀釋后，均勻添加至500 g供試土壤中并混合均勻，通風放置24 h至丙酮揮發完全，獲得土壤中莠去津終濃度為0.8 mg/kg的污染土壤，該濃度在已報道的土壤中莠去津的殘留濃度范圍內。均勻噴灑去離子水至田間最大持水量的60%，以不添加莠去津的土壤作為空白對照。將消毒后的水稻種子置于育苗盤中，當生長至三葉一心期時，選取5株長勢一致的水稻苗移栽至裝有500 g土壤的燒杯中，每個處理重復4次。每個燒杯中添加30 mL無菌水，每天補充水至初始水平，置于水稻溫室中培養。培養條件：200μmol/(m2·s)，14 h光照/10 h黑暗；晝/夜溫度為30/25℃。培養6 d后，參照馮發運等的方法收集每個燒杯中水稻的根際土壤，得到4個平行的待測土壤樣品。利用FastDNA®Spin Kit(MP Biomedical，Solon，OH，美國)提取土壤DNA，并通過NanoDrop 2000超微量核酸測定儀和瓊脂糖凝膠電泳法評估所提取DNA的樣品質量。以合格的土壤DNA樣品為模板，利用特異性引物338F(ACTCCTACGGGA GGCAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGT WTCTAAT)對16S rRNA基因的V3-V4區進行擴增。采用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)進行切膠回收，回收的產物送至上海美吉生物醫藥科技有限公司，基于Illumina Miseq平臺進行高通量測序，并通過云平臺進行數據分析。
1.3根際土壤中莠去津降解基因豐度測定
根據已報道的莠去津降解基因引物，采用定量PCR儀Bio-Rad CFX96對土壤中莠去津降解基因進行擴增，測定其豐度。將降解基因的PCR產物連接至pEASY-T3載體，并驗證基因序列。選擇序列正確的質粒以10倍梯度稀釋，測定不同濃度質粒的CT值，并換算成拷貝數，建立莠去津降解基因質粒的標準曲線。將1.2節中提取得到的不同土壤DNA進行熒光定量PCR擴增，并結合標準曲線計算各處理樣品中莠去津降解基因的拷貝數。采用Green qPCR SuperMix進行熒光定量PCR擴增，反應體系為：10μL 2×Mix，0.4μL上游引物，0.4μL下游引物，1μL DNA模板，8.2μL無菌水。反應程序為：94℃30 s，1個循環；94℃5 s，55℃15 s，72℃10 s，40個循環。
1.4莠去津降解菌的篩選及鑒定
取1.2節中制備的土壤樣品5 g，置于LB液體培養基中富集培養24 h后，依次轉移至含莠去津(2、10和50 mg/L)的MSM液體培養基中梯度馴化3次。取馴化培養后的菌液涂布于莠去津終濃度為10 mg/L的MSM固體培養基上，培養24 h后，挑取不同形態的菌落進行多代劃線培養，得到純化菌株。將純化后的單一菌株接種于含10 mg/L莠去津并以其為唯一碳源的MSM液體培養基中進行復篩，同時以不接菌的處理組為對照，30℃、180 r/min振蕩培養4 d后，通過高效液相色譜儀測定莠去津含量并計算降解率。MSM液體培養基中莠去津的提取與檢測參考李陽陽等的方法。提取其中具有降解功能菌株的DNA，用16S rRNA基因通用引物進行PCR擴增，并將擴增后的產物送至南京擎科生物科技有限公司測序，利用NCBI比對測序結果并構建系統進化樹，結合菌株的形態及生理生化特征，確定降解菌的菌屬。
1.5降解菌對莠去津脅迫下水稻的影響
試驗共設置4組處理：1)對照土壤+對照水稻；2)對照土壤+接菌水稻；3)含莠去津土壤+對照水稻；4)含莠去津土壤+接菌水稻，其中莠去津含量均為0.8 mg/kg。選擇降解能力最強的菌株AT2為目標菌株，用滅菌后的生理鹽水配制菌懸液至OD600約為1.0。將2份長勢一致的三葉一心期水稻苗置于上述菌懸液中浸根處理12 h，得到2份接菌水稻；2份對照水稻采用等量的無菌生理鹽水進行相同處理。將處理后的4份水稻分別種植于對照土壤和莠去津污染土壤中，培養6 d后測定水稻的相關生理指標、土壤和水稻中莠去津的含量以及水稻中莠去津降解基因的表達量。土壤和水稻中莠去津的提取與檢測方法采用Ma等的方法，回收率為89.6%～102.3%，滿足殘留農藥檢測要求。
水稻中莠去津降解基因表達量的測定：通過液氮將植物樣品研磨至粉末，利用植物總RNA提取試劑盒提取RNA，并通過1%瓊脂糖凝膠電泳和超微量紫外分光光度計檢測RNA的完整性和純度，取上述合格的RNA樣品(1.0μg)，經gDNA Eraser消除DNA后合成cDNA，并作為模板進行熒光定量PCR擴增。根據已報道的水稻中莠去津降解基因設計特異性引物，并以OsActin為內參基因。熒光定量PCR體系與反應程序同1.3節。
1.6數據分析
通過Excel 2016和Origin 2021軟件制圖。試驗結果采用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析(ANOVA)，并用Tukey檢驗進行多重比較；或采用Student’st-test(t檢驗)進行分析。
莠去津對水稻根際土壤微生物菌群結構及降解基因豐度的影響（一）
莠去津對水稻根際土壤微生物菌群結構及降解基因豐度的影響（二）
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