東北某市寒區(qū)湖庫型主體水和生物膜中耐氯菌數(shù)目、再生長現(xiàn)象研究（一）
由于氯的消毒效率高、穩(wěn)定性好、易于使用、成本低廉等優(yōu)勢，仍然是使用最廣泛的消毒劑。研究發(fā)現(xiàn)在保持一定余氯濃度的條件下，仍然有細菌能夠存活，甚至有一部分細菌能夠在含有較高余氯濃度的自來水廠、管網(wǎng)等供水系統(tǒng)中生存。這些對氯具有較高耐受性的細菌被稱作“耐氯菌”（chlorineresistant bacteria，也譯為“抗氯菌”）。然而，由于消毒效率跟測試的條件、方法密切相關，在科學的范疇上，耐氯菌的耐受性只是一個相對的概念，并不是一個準確的術語。
加氯消毒的過程本身就是對耐氯菌選擇的過程，也會使耐氯菌成為優(yōu)勢菌。這些存在于供水系統(tǒng)中的耐氯菌會對飲用水的安全性造成巨大危害。一方面有些耐氯菌本身就是病原菌或者條件致病菌，如分枝桿菌（Mycobacteriumspp.）、軍團菌（Legionellaspp.）、銅綠色假單胞桿菌（Pseudomonas aeruginosa）、金黃葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等；另一方面，由耐氯菌導致氯消毒的失效，并由此引發(fā)供水管網(wǎng)中的細菌再生長，進一步增加了細菌的耐氯性，使得供水管網(wǎng)中的細菌狀況進一步加劇，進而引起用戶龍頭水細菌總數(shù)、色度、濁度等水質指標超標。由于耐氯菌處于一個貧營養(yǎng)條件下并維持較高濃度余氯的極端環(huán)境體系下，大大限制了對供水管網(wǎng)中耐氯菌的研究。為此，對東北某市寒區(qū)湖庫型水源凈水廠加氯前后和供水管網(wǎng)中不同水齡、管道材質、管齡的主體水和生物膜中耐氯菌的變化規(guī)律進行研究，以期為供水微生物安全的評估、預防和控制提供理論基礎。
1實驗
1.1寒區(qū)湖庫型水源供水系統(tǒng)描述
該供水系統(tǒng)由典型的寒區(qū)湖庫型水源凈水廠供水，原水濁度為0.34——14 NTU，pH 6.10——7.49，堿度（CaCO3）8——48 mg/L，氨氮為0.04——0.20 mg/L.檢測數(shù)據(jù)均值中除大腸菌群為Ⅱ——Ⅲ類外，其他項目均滿足Ⅱ類水質。凈水廠建于2006—2009年，常規(guī)處理工藝為機械混合+水平軸機械絮凝+斜管沉淀+雙層濾料翻板濾池過濾+液氯消毒，設計總供水能力90×104m3/d，目前實際最高日供水量約為79×104m3/d，平均日供水量67×104m3/d.
根據(jù)該市的區(qū)域供水管網(wǎng)特征和水質特點，選取具有代表性的供水管網(wǎng)開展對比分析，該供水系統(tǒng)取樣點基礎信息見表1。
表1供水系統(tǒng)取樣點基礎信息
1.2分析測定方法
在該市某凈水廠清水池和供水系統(tǒng)（二次供水水箱）清洗期間（一般1年清洗1次，清洗時間為4月末—6月初或9—10月），于凈水廠濾池生物膜直接采集濾池反沖洗前期廢水顆粒（干樣約為10 g），采集清水池出水端下部高0.5 m處面積約50 cm×50 cm的池壁生物膜，水廠食堂連接水龍頭PPR管面積約100 cm2的管內壁生物膜，二次供水水箱進水端下部高0.15 m處面積約30 cm×30 cm池壁生物膜。在清洗前，開展供水系統(tǒng)的主體水水質測定，為期1 a，每月采集水樣一次，包括水廠濾后水、清水池出水、食堂龍頭水和各二次供水水箱市政進水5 L.所采得的生物膜和主體水水樣及時運回實驗室，并保存于4℃冰箱，在8 h內進行相關項目的分析。其中耐氯性細菌檢測的水樣與生物膜在同一時期內采集。
1.2.1生物膜和進出水異養(yǎng)菌平板計數(shù)（HPC）測定
將待計數(shù)的生物膜懸浮液置于超聲波振蕩器中冰浴超聲振蕩1 min，間歇1 min，如此重復3次，然后再漩渦振蕩30 s，使生物膜中的細菌能夠均勻分布在懸浮液中，之后將懸浮液稀釋適宜質量濃度在R2A固體培養(yǎng)基上進行異養(yǎng)菌總數(shù)平板計數(shù)（HPC-R2A）。R2A固體培養(yǎng)基主要成分：酵母0.5 g，酪蛋白酸水解物0.5 g，可溶性淀粉0.5 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，胰蛋白胨0.25 g，蛋白胨0.25 g，葡萄糖0.5 g，丙酮酸鈉0.3 g，K2HPO40.3 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 L;并用磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉調節(jié)pH為7.2——7.4.主體水、濾后水和供水末端水樣直接倍比稀釋，涂布于R2A固體培養(yǎng)基上；清水池和供水前端水樣用0.22μm濾膜過濾10——100 mL的水樣，然后將濾膜截濾微生物的一面向上貼于R2A固體培養(yǎng)基上進行HPC計數(shù)。將處理好的R2A培養(yǎng)基平板放于20℃倒置恒溫培養(yǎng)10 d，即可獲得異養(yǎng)菌平板計數(shù)。
1.2.2耐氯性細菌檢測
耐氯性細菌檢測參考陸品品和Mathieu等的方法，并做適當修改。對于生物膜樣品，在加氯前，引入超聲波和漩渦振蕩法分散細胞群體生物膜，使生物膜中的個體細胞釋放出來，盡量減少消毒劑在生物膜基質中擴散限制和反應抑制作用，使得氯能滲透到更多細菌個體細胞表面，耐氯的細菌得以檢出。檢測方法如圖1所示，將混勻的生物膜懸浮液（經(jīng)1.2.1方法處理）和主體水樣品，置于經(jīng)過滅菌處理的取樣瓶（1 L棕色細口瓶，密封）。其中1份樣品保持一定質量濃度的Cl2消毒劑（根據(jù)出廠水的平均余氯質量濃度，加入NaClO溶液使pH調至近中性。由于生物膜懸浮液會消耗更多的余氯，在生物膜懸浮液中比主體水中多加20%——50%的余氯溶液，混勻，待余氯穩(wěn)定后再測余氯質量濃度，使主體水和生物膜懸浮液的余氯終質量濃度均保持在0.60 mg/L），常溫過夜靜置12 h（根據(jù)該市的區(qū)域供水管網(wǎng)特征和水質特點，選取處于該市供水管網(wǎng)中間位置的H5采樣點的水力停留時間，具有代表性）；另1份樣品加入Na2S2O3，中止消毒，冷藏保存。12 h后，依據(jù)1.2.1的檢測方法取樣測定這2瓶水樣中的HPC-R2A值，重復3次以中止消毒樣品中HPC-R2A值作為管網(wǎng)出水細菌本底值，另一份樣品為維持消毒劑作用12 h后HPC-R2A值，作為管網(wǎng)出水可能的耐氯菌檢測值。
圖1耐氯性細菌檢測方法示意
1.2.3主體水其他水質測定方法
1.2.4掃描電鏡觀察
采用掃描電鏡觀察上述生物膜的形態(tài)，掃描電鏡樣品前處理方法：樣品在2.5%的戊二酸溶液中4℃固定過夜；倒掉固定液，用0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液漂洗樣品3次，每次15 min;冷凍干燥；樣品黏附在樣品臺上，噴金，在Quanta 200環(huán)境掃描電子顯微鏡（美國FEI公司）上觀察。
1.3數(shù)據(jù)處理方法
耐氯性細菌檢測時加入0.60 mg/L的Cl2，經(jīng)12 h的滅活率為D=log10（N0/Nc），其中N0為不加氯12 h后的HPC-R2A值，Nc為加氯12 h后的HPC-R2A值。運用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件對常規(guī)指標和細菌總數(shù)等進行方差分析和相關性分析。
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