大腸桿菌噬菌體Φ199一步生長曲線、與鹽酸克林霉素體外聯合應用效果（三）
2.3噬菌體Φ199一步生長曲線
如圖4示，噬菌體Φ199在前5 min內效價無明顯變化，5~10 min內效價急劇升高，然后趨于穩定。裂解量=裂解期平均噬菌斑數/潛伏期平均噬菌斑數。噬菌體Φ199的潛伏期為5 min，裂解期為5 min，裂解量為44。
(圖4：噬菌體Φ199一步生長曲線)
2.4噬菌體Φ199體外裂解曲線測定
將噬菌體Φ199與宿主菌以最佳MOI混合培養并持續觀察12 h，結果如圖5所示。在前3 h內，噬菌體Φ199能夠完全抑制大腸桿菌O157:H7的生長，未加噬菌體的大腸桿菌O157:H7則保持持續增長，空白對照組則未見細菌增長。
(圖5：噬菌體Φ199體外裂解曲線)
2.5噬菌體Φ199熱穩定性及pH穩定性
如圖6所示，在40~60℃時噬菌體Φ199能夠穩定存在，在70、80℃時噬菌體效價在1.5 h內急劇下降，在90℃孵育30 min后噬菌體效價降低至0。以上結果表明，噬菌體Φ199在40~60℃范圍內活性比較穩定，在70℃及以上溫度下較難長時間生存。
(圖6：噬菌體Φ199溫度敏感性)
(圖7：噬菌體Φ199 pH值敏感性)
如圖7所示，噬菌體Φ199在pH值為3~12時具有較好的活性，pH值為2和13時完全喪失活性。這些結果表明噬菌體Φ199對酸堿具有一定的耐受性，在pH值3~12時可以穩定存在。
2.6鹽酸克林霉素的MIC值
通過將細菌與不同濃度抗生素共同孵育以探究大腸桿菌對鹽酸克林霉素的MIC，結果鹽酸克林霉素對大腸桿菌O157:H7的MIC為64μg/mL。
2.7噬菌體Φ199與鹽酸克林霉素體外抗菌應用
將鹽酸克林霉素與噬菌體Φ199體外聯合應用，旨在探索二者聯用效果。通過肉眼直接觀察噬菌體與細菌聯用后MIC的變化，結果如圖8A所示。當噬菌體濃度為10^5 PFU/mL時，鹽酸克林霉素的MIC仍為64μg/mL；噬菌體濃度為10^6 PFU/mL和10^7 PFU/mL時，抗生素的有效濃度降為1/2 MIC；當噬菌體濃度為10^8 PFU/mL時，抗生素的有效濃度降至1/4 MIC。
進一步檢測細菌OD600 nm值并計算抗菌效率，圖8B呈現了噬菌體與鹽酸克林霉素聯合應用的效果，數值代表細菌的清除效率，數值越大，顏色越淺，表明清除細菌的效果越好，其結果與圖8A一致。
(圖8：鹽酸克林霉素與噬菌體Φ199聯合應用的抗菌效果)
3討論
本研究檢測了以大腸桿菌O157:H7為宿主菌的噬菌體Φ199的生物學特性，并且噬菌體Φ199與鹽酸克林霉素聯用后能夠降低大腸桿菌對鹽酸克林霉素的MIC。噬菌體Φ199的生物學特性顯示，其最佳MOI為1，能夠在雙層瓊脂平板上形成清晰的噬菌斑。裂解曲線顯示，噬菌體Φ199能夠在3 h內達到良好的抑菌效果。通過透射電鏡觀察到噬菌體Φ199屬于肌尾型噬菌體，具有直徑約為50 nm的頭部和長度約為100 nm的尾部。溫度、酸堿度的變化能夠影響噬菌體的生存和生產，作為一種生命體，噬菌體只有在活性良好的情況下才能夠發揮理想的殺菌作用。通過檢測噬菌體在不同溫度和pH值條件下的生存能力顯示，噬菌體Φ199在40~60℃范圍內能夠保持較高的活性，在pH值3~12范圍具有較高的生物學活性，表明其能夠在較寬的溫度和酸堿環境下生存，證實該噬菌體具有良好的應用前景。
由于抗生素的濫用，導致臨床上細菌耐藥性問題嚴重，且由于超級細菌的形成導致采用單一抗生素或抗菌藥物無法達到良好的治療效果，因此在臨床或試驗中常使用多種抗菌藥物聯合抗菌。目前已有較多的研究報告顯示，與單一噬菌體或抗生素相比，噬菌體與抗生素聯用具有協同作用，可以避免細菌感染或生物被膜的形成。此外，越來越多的臨床醫療者將噬菌體與抗生素聯合應用以治療多重耐藥細菌感染引起的疾病，并且取得了較為顯著的治療效果。鹽酸克林霉素具有廣譜抗菌活性，主要通過與細菌核糖體的50S亞單位結合，抑制細菌肽鏈延長，從而抑制細菌蛋白質合成。鹽酸克林霉素還可通過破壞細菌的表面結構和抑制細菌的生物活性來殺傷細菌，并有利于吞噬細胞的吞噬。
本研究顯示，單獨使用鹽酸克林霉素時，鹽酸克林霉素對大腸桿菌的MIC為64μg/mL，抗菌效果較差。單獨使用噬菌體時，10^6~10^8 PFU/mL的噬菌體Φ199都無法在12 h內抑制大腸桿菌O157:H7的生長。聯合用藥后結果顯示，在噬菌體濃度為10^6~10^7 PFU/mL時，能夠將抗生素有效使用濃度降至1/2 MIC；在噬菌體濃度為10^8 PFU/mL時，能夠使抗生素的有效使用濃度降至1/4 MIC，表明聯合應用可以協同或增加藥物的抗菌效果。有研究表明噬菌體與抗生素聯用能夠降低抗生素的使用濃度至1/2 MIC，而本試驗降低抗生素使用濃度至1/4 MIC，顯著提高了聯用效果。這種聯用效果的產生可能是由兩方面因素導致的：一方面是細菌可能因為遺傳限制使其無法高效產生2種抗菌機制的突變，并且抵抗不同抗菌機制之間可能存在相互負作用，即增強一種抵抗能力的同時會削弱另一種抵抗能力，且細菌莢膜對噬菌體的吸附十分重要，細菌可能通過丟失莢膜來改變噬菌體對其吸附能力，但是莢膜的丟失可能導致耐藥細菌對抗生素重新敏感；另一方面，抗生素和噬菌體協同作用可能迅速降低了細菌密度，從而降低了耐藥突變的概率。
綜上，本研究發現了一種能夠裂解大腸桿菌O157:H7的裂解性噬菌體Φ199，其與鹽酸克林霉素聯用后能夠在體外有效抑制細菌生長，表明這種聯用方法對于控制由耐藥性大腸桿菌O157:H7引起的感染具有潛在的應用價值。然而，目前噬菌體與抗生素聯用的方法仍然存在一些需要解決的問題：一方面是噬菌體可能與抗菌劑之間存在拮抗作用，導致聯用后治療效果低于抗生素治療效果；另一方面是噬菌體與抗生素聯用仍然可能導致細菌內毒素和毒性蛋白的釋放，造成機體損傷。本試驗沒有檢測噬菌體的耐藥基因，以及聯用后大腸桿菌O157:H7內毒素、志賀毒素等毒素物質的釋放。相關試驗表明，使用噬菌體和抗生素治療時能夠降低有毒物質的釋放，提高對動物的治療效果，且能夠減少細菌耐藥性的發展。相信隨著研究的深入，以上問題將會得到解決，從而促進噬菌體-抗生素聯合應用的發展和普及。
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