三種抗菌藥物處理后持留菌株和抗藥菌株生長曲線、優勢的比較——摘要、材料與方法
摘要：以64倍最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的氨芐西林、環丙沙星、多粘菌素三種抗菌藥物分別處理大腸桿菌ATCC 25922，去除藥物后，保持原始菌株藥物敏感性的存活菌株為持留菌株;另用濃度遞增的亞致死量的三種抗菌藥物培養基連續對大腸桿菌ATCC 25922進行分批培養，獲得能夠耐受一定藥物濃度的抗藥性增強的菌株，去除藥物后，菌株穩定的MIC值仍顯著高于原始菌株，為抗藥菌株。以穩定的MIC范圍為檢測指標，比較原始菌株的持留菌株和抗藥菌株后續的生長優勢。結果表明：經過一段時間的混合培養，持留菌株在95%以上，數量上占絕對優勢，說明持留菌株比抗藥菌株具有更強的生長優勢，由此引發對抗藥性回復的重新思考，自然界中持留菌株的特性、形成及存在可能為抗藥性的逆轉預留了一條途徑。
抗菌藥物的發現和使用大大降低了細菌感染性疾病導致的死亡率，但隨著抗菌藥物的廣泛應用，人類和動物病原菌的抗藥性問題凸顯并引起全球高度關注。抗菌藥物使用之初就有相關抗藥性的報道，至今有關細菌抗藥性的起源、發展和傳播已有了相當的積累。研究表明細菌抗藥性可以通過多種機制產生，如編碼靶蛋白的基因突變、藥物滲透降低、細菌外排泵的外排功能激活、靶蛋白旁路、非酶的靶位保護、酶靶位修飾等，細菌通過整合各種可能的機制形成抗藥性表型，并且可遺傳的抗藥性能夠通過可移動遺傳因子進行水平轉移，尤其在抗菌藥物選擇壓力下，越來越多的“超級細菌”逐漸產生，對人類健康造成巨大威脅。
細菌的持留性（persistance）不同于抗藥性，表型上，持留菌雖然也能夠耐過遠高于MIC的藥物濃度得以存活，卻保留了原始菌株的藥物敏感特性。早在1944年，Bigger發現青霉素并不能完全殺死金黃色葡萄球菌，其中極小一部分可以存活，認為其表現為休眠狀態、非可遺傳表型。抗菌藥物可以殺死大部分細菌，但總有一小部分不能被抗菌藥物殺滅，當這些存活的亞群在同樣的抗菌藥物條件下生長，會重復這種異質特性，這種現象叫做細菌持留性，存活的細菌叫做持留菌。持留菌的形成機制尚不明確，目前已有的研究包括持留性相關基因如hipA、毒素/抗毒素（TA）系統和外排泵系統等，與細菌抗藥性一樣，持留性也是多因素共同參與形成的。
持留菌和抗藥菌的本質和形成機制不同，但共存于抗菌藥物壓力下的細菌群體中。在對持留菌的研究中，普遍認為持留菌在抗藥性中起到了至關重要的“幫兇”作用，研究思路多為阻斷持留菌的形成和阻止進入休眠狀態。而本文思路是從生態角度審視抗菌藥物使用過程中，休眠的持留菌在抗藥性回復中可能的作用及當去除藥物后二者在菌群后續繁殖中各自發揮怎樣的作用。在體外條件下采用氨芐西林、環丙沙星和多粘菌素三種不同類型的常用抗菌藥物，以不同方式對原始菌株進行處理，獲得原始菌株的持留菌株和抗藥菌株，比較其藥敏特性和相同生態環境中的生長優勢，并探討持留菌存在的意義及其在抗藥性回復中潛在的作用。
1材料與方法
1.1試驗材料
菌株：藥物敏感性試驗質控菌株大腸桿菌ATCC 25922，由山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室保存。
試劑與藥品：氨芐西林、環丙沙星和多粘菌素，購自中國藥品生物制品檢定所，分析純;MH液體培養基（MHB）、MH固體培養基（MHA），購自北京陸橋技術有限責任公司。
1.2試驗方法
1.2.1 MIC測定
根據美國臨床和實驗室標準協會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）建立的標準藥敏方法，采用微量肉湯稀釋法，測定原始菌株、持留菌及抗藥菌株對氨芐西林、環丙沙星、多粘菌素三種抗菌藥物的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。
1.2.2高藥物濃度下獲得持留菌株
用微量肉湯稀釋法測定大腸桿菌ATCC 25922 MIC后，在96孔板上，將氨芐西林、環丙沙星和多粘菌素的藥物濃度分別設置為各種藥物MIC的64倍（氨芐西林256μg/mL，環丙沙星1μg/mL，多粘菌素32μg/mL），按照藥敏試驗方法的接種量接入穩定期大腸桿菌ATCC 25922，每種藥做18個重復孔，37℃靜置培養。分別于6 d內每天取3個重復樣，將每孔液體共200μL全部取出，10 000 r/min離心5 min，用200μL生理鹽水洗滌2次，加50μL生理鹽水重懸后涂布MHA平板，培養24～48 h，計算菌落數，測定MIC。
1.2.3在遞增的亞致死量
藥物濃度下分批傳代獲得抗藥菌株取大腸桿菌ATCC 25922接種于裝有50 mL MHB的三角瓶中（接種量為1%，V/V），氨芐西林、環丙沙星和多粘菌素的終濃度分別為各自的1/2 MIC，12 h后轉接到下一個三角瓶中（藥物濃度不變），培養12 h后再轉接到藥物濃度倍增的三角瓶中;藥物濃度由1/2 MIC連續倍比遞增至64倍MIC，每一濃度傳代2次，第二次培養細菌生長后劃線于含相同濃度藥物的MHA平板，過夜培養，挑取生長良好的單菌落并測定MIC。然后將其在無藥MHB中連續傳代直至MIC穩定，獲得一系列MIC穩定的抗藥性增強的菌株。
1.2.4持留菌株與抗藥菌株的生長曲線測定
將獲得的原始菌的持留菌株和抗藥菌株在丹麥Biosense微生物生長動態監測儀中37℃培養900 min，每15 min在線連續測量OD600，比較不同菌株的生長曲線是否存在差異。
1.2.5持留菌株和抗藥菌株的MIC范圍
分別選取氨芐西林、環丙沙星和多粘菌素三種藥物原始菌的持留菌株和抗藥菌株，挑取單菌落分別接種于等體積的MHB中，以同樣的條件振蕩培養16～18 h，各取菌液1 mL稀釋至適當濃度，涂布于MHA平板獲得單菌落，各取100個單菌落進行MIC測定，統計不同菌株各自的MIC分布范圍。
1.2.6持留菌株和抗藥菌株生長優勢的比較
根據1.2.5中測定的MIC頻率分布結果，選取各自MIC范圍沒有交叉的持留菌株和抗藥菌株，等比例接種培養基混合培養，以各自MIC為檢測指標統計二者組成比例的變化。具體方法：挑取氨芐西林、環丙沙星和多粘菌素的持留菌株和抗藥菌株的單菌落，分別接種于MHB中，37℃、200 r/min振蕩培養12 h，用MHB稀釋，于紫外-可見光分析儀（GE Ultrospec 3100 pro）檢測OD600，調節至0.08～0.10范圍內，盡量調整稀釋倍數使其最終達到相同的OD600值，確保小數點后兩位相同。以此濃度各取500μL，同時接種于含有100 mL MHB的三角瓶中，等比例接種后混合振蕩培養，每天取1 mL轉接入新的100 mL MHB中，連續轉移傳代7 d甚至更長時間。每次培養后取混合菌液稀釋至合適濃度，涂布獲得單菌落100株，測定其MIC。以1.2.5中測定的MIC頻率分布為指標，統計菌液中持留菌株和抗藥菌株來源的大腸桿菌的比例。
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