芐嘧磺隆降解菌株75B的生長曲線、生長及降解（一）
芐嘧磺隆是一種磺酰脲類除草劑，被廣泛應(yīng)用于稻田土壤中防除一年生和多年生闊葉雜草。在土壤中的持效期較長，大量施用后易對后茬敏感作物產(chǎn)生藥害，微生物降解是土壤中芐嘧磺隆轉(zhuǎn)化的主要方式。本研究從長期施用該除草劑的稻田土壤中分離篩選到1株芐嘧磺隆降解菌株75B，經(jīng)形態(tài)學(xué)及生理生化特征、16S rRNA基因擴增測序構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析，鑒定為Klebsiellapneumoniae(肺炎克雷伯氏菌)。75B菌株對環(huán)境的適應(yīng)能力較強，在pH 5.09.0、0.55.0%NaCl濃度下、培養(yǎng)溫度為2638℃的范圍內(nèi)生長良好。將該菌株按5%接種量置于pH 7.0、以芐嘧磺隆為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基(2.0%NaCl濃度)中、34℃條件下培養(yǎng)，對50 mg/L芐嘧磺隆的5 d降解率為74.11%，培養(yǎng)至10 d時的降解率為97.65%。結(jié)果表明75B菌株可以有效地降解芐嘧磺隆，具有應(yīng)用于該除草劑污染環(huán)境修復(fù)的潛力。
芐嘧磺隆(Bensulfuron-methyl，BSM)是一種磺酰脲類除草劑，可以抑制乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase，ALS)的活性，導(dǎo)致植物支鏈氨基酸的合成受阻而起殺草作用。由于其選擇性高，對禾本科植物無害，因而被廣泛應(yīng)用于稻田土壤中防除一年生和多年生闊葉雜草和莎草。芐嘧磺隆具有揮發(fā)性低、難以光降解，在堿性土壤中的持效期長達(dá)100 d以上的特征。大量應(yīng)用后不僅對后茬輪作作物有毒、損傷煙草和番茄等敏感作物，而且其殘留可通過滲濾增加鄰近水生環(huán)境污染的可能性。研究已經(jīng)證明BSM對水生蕨類和淡水藍(lán)藻有高度毒性。較高濃度(3.553 mg/kg)BSM的處理可造成土壤微生物多樣性降低，嚴(yán)重抑制需氧性細(xì)菌、固氮菌、纖維素分解菌及氨化細(xì)菌的生長，減少了土壤固氮過程和硝化作用的進(jìn)行；還可導(dǎo)致Pseudomonasputida(惡臭假單胞菌)的急性毒性效應(yīng)。然而，利用14C標(biāo)記技術(shù)對施加芐嘧磺隆的稻田土壤進(jìn)行降解研究，發(fā)現(xiàn)重復(fù)施用BSM的稻田土壤中礦化產(chǎn)生14CO2的速率更快，表明土壤細(xì)菌可以利用BSM為碳源和能源；顯然，通過微生物酶系統(tǒng)發(fā)揮的微生物降解仍然是芐嘧磺隆在土壤中轉(zhuǎn)化的決定性機制。但是，自2005年首次分離到可以降解芐嘧磺隆的Brevibacteriumsp.BH菌株后，近年來芐嘧磺隆的降解微生物報道仍較少。
為了豐富芐嘧磺隆的降解菌株，本研究從長期施用芐嘧磺隆除草劑的農(nóng)田土壤中，分離篩選到1株Klebsiellapneumoniae，并對其生長降解特性進(jìn)行了研究，以期為芐嘧磺隆污染土壤的生物修復(fù)提供理論依據(jù)和菌種資源。
1材料與方法
1.1土樣采集
采集土樣來自貴州省貴陽市花溪區(qū)常年施用野老除草劑(含芐嘧磺隆6%，乙草胺16.7%)的稻田淹水土壤(北緯N26°26′18.23″，東經(jīng)E106°39′45.32″，海拔1 125.35 m)，土壤為黃壤、pH值6.0。
1.2培養(yǎng)基
基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基(minimal sodium medium，MSM)：NH4NO31.0 g，NaCl 1.0 g，MgSO40.1 g，KH2PO40.5 g，K2HPO41.5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0，121℃滅菌30 min。
LB培養(yǎng)基：酵母膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 10.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0，121℃滅菌30 min。
固體培養(yǎng)基均加入2.0%瓊脂。
1.3主要試劑及儀器
主要試劑：芐嘧磺隆標(biāo)品(Sigma-Aldrich，USA)，10%芐嘧磺隆原藥(安徽華星化工股份有限公司)，除乙腈和甲醇為色譜純外，其余試劑均為國產(chǎn)分析純；分子生物學(xué)試劑Premix rTaq購自TakaRa，Bacterial DNA Kit購自O(shè)mega；主要儀器為T100 PCR儀(Bio-Rad，USA)，Chemi Doc XRS+凝膠成像儀(Bio-Rad，USA)，Waters 600高效液相色譜系統(tǒng)(Waters，USA)。
引物合成及產(chǎn)物測序均由上海英駿生物工程有限公司完成。
1.4芐嘧磺隆降解菌的分離
稱取土壤10.0 g加入100 mL含10 mg/L芐嘧磺隆的無機鹽培養(yǎng)基中，于30℃恒溫振蕩培養(yǎng)器中150 rpm振蕩培養(yǎng)，每隔10 d轉(zhuǎn)接一次，逐步提高培養(yǎng)基中的芐嘧磺隆濃度，連續(xù)馴化、富集培養(yǎng)6次，直至芐嘧磺隆濃度為250 mg/L。取最后一次富集培養(yǎng)液適量，稀釋后涂布培養(yǎng)于含50 mg/L芐嘧磺隆的MSM固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)4 d左右，挑選生長良好的菌落進(jìn)行分離純化并保種。
1.5芐嘧磺隆降解菌株的鑒定
1.5.1降解菌株的形態(tài)及生理生化鑒定純化的單菌落接種到LB固體培養(yǎng)基中活化兩次后觀察菌落形態(tài)，挑取少量單菌落涂片進(jìn)行Gram染色后光學(xué)顯微鏡觀察。生理生化的鑒定依照《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》進(jìn)行。
1.5.2降解菌株的分子鑒定利用Bacterial DNA Kit提取細(xì)菌DNA，以降解菌DNA為模板，利用細(xì)菌16S rRNA基因擴增的通用引物27f(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)、1492r(5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行PCR擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，有目的大小條帶者送出測序。測序獲得的16S r RNA基因序列使用BLAST進(jìn)行同源性比較，同時聯(lián)合EzTaxon-e服務(wù)器的模式種細(xì)菌菌株比對進(jìn)行分子鑒定。利用MEGA6.0中的鄰近法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行1 000次自展檢驗。
1.6不同環(huán)境因素對芐嘧磺隆降解菌株生長的影響
1.6.1降解菌株的生長曲線將活化菌液分別接種于LB培養(yǎng)基和含50 mg/L芐嘧磺隆的LB培養(yǎng)基中，使得培養(yǎng)液起始OD600值為0.2左右，于30℃150 rpm振蕩培養(yǎng)，定時取樣測定菌體生長量。
1.6.2培養(yǎng)基不同pH值對降解菌株生長的影響將活化菌液接種于60 mL含50 mg/L芐嘧磺隆的LB培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，于30℃150 rpm振蕩培養(yǎng)，定時取樣測定OD600值。
1.6.3培養(yǎng)基中不同NaCl濃度對降解菌株生長的影響在含50 mg/L芐嘧磺隆的60 mL LB培養(yǎng)基中(原有NaCl濃度為0.5%)，分別添加NaCl使其鹽濃度分別為1.0、2.0和5.0%，接種菌液于30℃振蕩培養(yǎng)并測定OD600值。
1.6.4不同接種量對降解菌株生長的影響將活化的菌液調(diào)節(jié)OD600值為1.0，按1.0、5.0、7.0和10.0%的接種量分別轉(zhuǎn)接入含50 mg/L芐嘧磺隆的60 mL LB培養(yǎng)基中，于30℃振蕩培養(yǎng)并測定OD600值。
1.6.5不同裝液量對降解菌生長的影響分別取20、40和60 LB培養(yǎng)基(含50 mg/L芐嘧磺隆)裝入100 mL三角瓶中，接入菌液于30℃振蕩培養(yǎng)并測定OD600值。
1.6.6不同培養(yǎng)溫度對降解菌生長的影響將活化菌液轉(zhuǎn)接入60 mL LB培養(yǎng)基(含50 mg/L芐嘧磺隆)中，分別在26、30、34和38℃條件下振蕩培養(yǎng)并測定OD600值。以上每個處理均設(shè)三個重復(fù)。
1.7降解菌株在以芐嘧磺隆為唯一碳源培養(yǎng)基中的生長及降解
將活化菌液6000 rpm離心5 min后棄上清，菌體沉淀用MSM培養(yǎng)液洗滌2次后重懸。重懸菌液分別接種于含50、100和150 mg/L芐嘧磺隆的MSM培養(yǎng)基中，在最適生長條件下置于恒溫?fù)u床中150 rpm振蕩培養(yǎng)，定時取樣測定OD600值。每個處理設(shè)三個重復(fù)。選擇菌體生長較好的培養(yǎng)液處理后，HPLC測定其中的芐嘧磺隆濃度并計算降解率。
培養(yǎng)液中芐嘧磺隆的提取及濃度測定參考李陽陽方法，簡而言之，取適量培養(yǎng)液加入3倍體積的二氯甲烷萃取、無水硫酸鈉吸去水分，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干后加入色譜級甲醇溶解、過濾后利用HPLC測定培養(yǎng)液中的芐嘧磺隆含量。HPLC測定的色譜柱為AsilentTC-C18柱，以甲醇為流動相，流速1.0 mL/min，檢測波長為210 nm。
1.8數(shù)據(jù)處理
試驗數(shù)據(jù)處理采用Excel 2010和SPSS19.0軟件，多重比較采用LSD法。
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