草魚呼腸孤病毒培養與滴度測定、及在草魚、CIK細胞上的生長特性研究（二）
1.3.3靈敏性試驗及標準曲線繪制對重組質粒10倍梯度稀釋后，進行熒光定量PCR擴增。參照SYBR Green熒光定量試劑盒說明書，分別取稀釋好的重組質粒1μL為模板進行PCR擴增。反應體系為：2×SYBR GreenⅠPCR反應混合液10μL，10 pmol/L的上、下游引物各1μL，加ddH2O補足20μL。反應采用三溫循環，程序為：95℃預變性10 s；95℃變性5 s，56℃退火30 s；72℃延伸15 s，40個循環，并收集熒光信號。
1.3.4特異性試驗分別取GCRV 873毒株、傳染性造血器官壞死癥病毒（IHNV）、鯉魚春季病毒血癥病毒（SVCV）核酸，以其為模板進行Realtime PCR擴增，20μL體系加模板1μL，并設立陰性對照。
1.4病毒培養與滴度測定
將保存于液氮中的GCRV 873毒株接種于長成致密單層的CIK細胞，28℃吸附1 h；吸棄病毒液，加入與培養液等量的維持液（含2%FBS的M199），28℃恒溫培養。每日觀察細胞形態，直至出現80%細胞病變，收取病毒液進行滴度測定。GCRV873的細胞培養液經反復凍融后作連續10倍梯度稀釋，取10-3～10-108個稀釋度，每個稀釋度取100μL的病毒液接種于96孔板上的單層CIK細胞；每稀釋度接種8孔，28℃孵育1 h后棄去，加入維持液繼續培養，并設正常細胞為對照，連續觀察7 d。根據病變情況，按Karber氏法計算半數組織培養感染劑量（TCID50）。lgTCID50=L+d（s?0.5）。式中：L為病毒最低稀釋度的對數，d為組距（稀釋系數），s為各組病變數與接種數比值之和。
1.5 GCRV 873株在CIK細胞上的生長特性研究
CIK細胞培養于24孔細胞板，待細胞長至致密單層時，棄去培養液，用1×104TCID50/mL，每孔100μL的GCRV 873毒株感染細胞。感染后分別于0、2、4、8、10、12、24、36、48、72 h收取病毒細胞培養液，應用建立的Real-time PCR方法檢測定各時間點的病毒RNA增殖情況，并通過對各個時間點病毒滴度的測定，檢測病毒拷貝數，同時分別顯微鏡觀察0、12、24、36、48、72 h的CIK病變情況。
1.6 GCRV 873株在草魚體內的生長特性研究
試驗魚用MS222溶液（1 mg/L）麻醉，每尾草魚腹腔注射TCID50為1×106的GCRV 0.1 mL，對照組每尾注射同等劑量的滅菌生理鹽水。于注射后1、2、3、5、7 d取樣，每組隨機選取4尾試驗魚，用MS222（1 mg/L）麻醉后，取其肝臟、脾臟、腎臟，用Trizol提取各組織RNA后反轉錄為cDNA，應用Real-time PCR方法測定肝臟、脾臟、腎臟中的病毒含量。
1.7數據分析
熒光定量PCR反應結束后，查看擴增曲線和Ct值等；通過標準曲線換算得到樣品中內參基因β-actin和病毒基因組的絕對拷貝數，再經β-actin校正得到相應的相對拷貝數。
2結果
2.1 Real-time PCR檢測方法的建立
用特異性熒光定量引物VP6-U/VP6-L對病毒核酸進行PCR擴增，將得到的產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，發現擴增片段與預期大小（102 bp）一致，且特異性好（圖1）。將擴增片段克隆到pMD-18T后送測序，發現序列與Genebank上公布的序列一致。從不同稀釋度的標準品Real-time PCR擴增反應（圖2）可以看出，從1×101～1×106個拷貝數的質粒擴增曲線均呈“S”型，且與指數增長期的擴增曲線平行，反映出PCR的擴增效率相近，檢測靈敏度為1×101個病毒粒子。以質粒拷貝數的對數為X軸，以Ct值為Y軸，根據兩者的相關性得到標準曲線Y=3.237×log（X）+39.63，其相關系數R2為0.999，擴增效率為103.7%。特異性試驗結果顯示（圖3），GCRV病毒核酸擴增曲線呈“S”型，而IHNV、SVCV及陰性對照均沒有擴增曲線，說明所建立的檢測方法特異性好。
圖1引物VP6-U、VP6-L PCR擴增結果