芐嘧磺隆降解菌株75B的生長(zhǎng)曲線、生長(zhǎng)及降解（二）
2結(jié)果與分析
2.1芐嘧磺隆降解菌株的分離與鑒定
利用長(zhǎng)期使用野老除草劑的稻田土壤為材料，通過逐步提高培養(yǎng)基中芐嘧磺隆濃度的方法，經(jīng)近兩個(gè)月的馴化及富集培養(yǎng)，最終分離純化獲得1個(gè)細(xì)菌菌株，該菌株在含50 mg/L芐嘧磺隆的MSM固體培養(yǎng)基平板上生良好，命名為75B。
降解菌株75B在LB固體平板上培養(yǎng)24 h后，呈現(xiàn)出半透明、光滑、隆起的乳白色光澤感菌落；鏡檢為G-的桿狀細(xì)菌(圖1)。生理生化測(cè)試表明，該菌株M.R試驗(yàn)、V.P試驗(yàn)、氧化酶及過氧化氫酶陰性；苯丙氨酸水解、淀粉水解、酪素水解陰性；硝酸鹽還原、纖維素分解、丙酸鹽利用陽性；有莢膜；可發(fā)酵葡萄糖、乳糖、核糖醇，不能利用山梨糖和5-酮基-D-葡萄糖酸。
利用16S rRNA基因擴(kuò)增的通用引物，以75B菌株的總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳顯示擴(kuò)增到1.5 kb大小目的條帶。測(cè)序產(chǎn)物經(jīng)BLAST及EzTaxon-e服務(wù)器鑒定，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)，表明75B菌株的16S rRNA基因與Klebsiellavariicola及Klebsiellapneumoniae同源性極高，分子鑒定為Klebsiellasp.。
結(jié)合生理生化測(cè)定及分子生物學(xué)方法，最終將芐嘧磺隆降解菌75B鑒定為Klebsiellapneumoniae(肺炎克雷伯氏菌)。
圖1芐嘧磺隆降解菌75B的菌落和鏡下Gram染色圖譜
2.2芐嘧磺隆降解菌株75B在不同環(huán)境條件下的生長(zhǎng)
2.2.1降解菌株75B在不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線當(dāng)把降解菌株75B接種入LB、含50 mg/L芐嘧磺隆的LB培養(yǎng)基中，結(jié)果顯示出相似的生長(zhǎng)趨勢(shì)；另外，在LB培養(yǎng)基中加入50 mg/L芐嘧磺隆后，降解菌株75B的生長(zhǎng)稍稍有所滯后，表明芐嘧磺隆的加入對(duì)于芐嘧磺隆降解菌株仍然存在略微的影響，這主要表現(xiàn)在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的生長(zhǎng)速率有所降低。但是，當(dāng)培養(yǎng)至穩(wěn)定期后期(24 h)，在兩種培養(yǎng)基中的菌體生長(zhǎng)量(OD600值)并未有顯著差別(p0.05)(圖3)，降解菌株可以快速適應(yīng)芐嘧磺隆的存在。
圖2芐嘧磺隆降解菌75B的16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹
圖3芐嘧磺隆降解菌株75B的生長(zhǎng)曲線
2.2.2培養(yǎng)基不同pH值及NaCl濃度對(duì)降解菌株生長(zhǎng)的影響在不同pH值的LB培養(yǎng)基(含50 mg/L芐嘧磺隆)中，降解菌株75B的菌體生長(zhǎng)量在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期存在差異，pH 7.0的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速率最快(p0.05)，最適pH值為7.0。進(jìn)入穩(wěn)定期后期，pH值對(duì)菌體生長(zhǎng)量的影響下降，該菌株在pH 5.09.0范圍內(nèi)生長(zhǎng)良好，表明75B對(duì)環(huán)境pH值有較強(qiáng)的適應(yīng)能力(圖4)。
2.2.3不同接種量及裝液量對(duì)降解菌株生長(zhǎng)的影響設(shè)置4個(gè)不同接種量接種菌液，結(jié)果表明，在接種量為1%時(shí)，75B菌株的菌體生長(zhǎng)量低于其余3個(gè)處理，而當(dāng)接種量為5.0～10.0%范圍內(nèi)時(shí)，菌體OD600值并無顯著差異(p<0.05)。因而，適當(dāng)加大接種量可使菌體縮短適應(yīng)期而進(jìn)入快速生長(zhǎng)階段，但接種量與菌體生長(zhǎng)量之間并不呈完全對(duì)應(yīng)增長(zhǎng)趨勢(shì)，降解菌株75B的最適接種量為5.0%。而在3個(gè)不同的裝液體積下，菌體生長(zhǎng)量并無明顯差異(圖5)。
注：上圖為不同pH值，下圖為不同NaCl濃度，*代表差異顯著(p<0.05)
圖4培養(yǎng)基不同pH值及NaCl濃度對(duì)芐嘧磺隆降解菌株75B生長(zhǎng)的影響
2.2.4不同培養(yǎng)溫度對(duì)降解菌株生長(zhǎng)的影響溫度通常對(duì)微生物的生長(zhǎng)影響較大。在4個(gè)不同的溫度條件下培養(yǎng)75B菌株，34℃條件下的菌體生長(zhǎng)量略高；除在培養(yǎng)初期(12 h)，測(cè)試的最低溫度(26℃)及最高溫度(38℃)下菌體OD600值略低于其余處理外；總體上，在26～38℃溫度范圍內(nèi)，芐嘧磺隆降解菌株75B的生長(zhǎng)良好，菌株可以耐受較廣的溫度范圍。
注：上圖為不同接種量，下圖為不同裝液量，*代表差異顯著(p<0.05)
圖5接種量及裝液量對(duì)芐嘧磺隆降解菌株75B生長(zhǎng)的影響
圖6不同培養(yǎng)溫度對(duì)芐嘧磺隆降解菌75B生長(zhǎng)的影響
2.3芐嘧磺隆降解菌株75B的生長(zhǎng)及降解
將活化的75B菌株培養(yǎng)液以5%接種量、轉(zhuǎn)接入以芐嘧磺隆為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基(pH 7.0，含2.0%NaCl)中，34℃搖床振蕩培養(yǎng)監(jiān)測(cè)菌體生長(zhǎng)量。結(jié)果表明，菌體在150 mg/L芐嘧磺隆的培養(yǎng)基中基本無生長(zhǎng)；而50 mg/L和100 mg/L濃度下菌體的延滯期達(dá)3 d左右，之后OD600值開始逐漸呈上升趨勢(shì)。在含50 mg/L芐嘧磺隆的MSM培養(yǎng)基中，75B菌株的生長(zhǎng)明顯優(yōu)于另兩組處理(p0.05)(圖7)。收集該濃度下的菌體培養(yǎng)液，經(jīng)萃取、蒸干后進(jìn)行HPLC測(cè)定，顯示75B菌株對(duì)50 mg/L芐嘧磺隆的5 d降解率為74.11%，培養(yǎng)至10 d時(shí)的降解率高達(dá)97.65%(圖8)。
注：*代表差異顯著(p<0.05)
圖7降解菌株75B在以不同濃度芐嘧磺隆為唯一碳源MSM培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)
圖8芐嘧磺隆降解菌株75B對(duì)50 mg/L芐嘧磺隆的降解能力
3結(jié)論
芐嘧磺隆是20世紀(jì)80年代中期開發(fā)的一種新型磺酰脲類除草劑，是我國(guó)水稻田中使用面積廣、時(shí)間長(zhǎng)、用量大的除草劑之一。由于其在土壤中的持效期較長(zhǎng)，大量施用后會(huì)對(duì)環(huán)境造成一定危害。本研究采集長(zhǎng)期施用野老除草劑(含芐嘧磺隆6%)的稻田土壤，經(jīng)富集、馴化后分離到1株芐嘧磺隆降解菌株75B，形態(tài)學(xué)、生理生化研究及分子生物學(xué)研究結(jié)果顯示該菌株為Klebsiellapneumoniae(肺炎克雷伯氏菌)，該菌株對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力較強(qiáng)，生長(zhǎng)在pH 7.0、含50 mg/L芐嘧磺隆的無機(jī)鹽培養(yǎng)基(2.0%NaCl)中，34℃條件下培養(yǎng)10 d，對(duì)芐嘧磺隆的降解率可達(dá)97.65%。
Zhu等在2005年首次報(bào)道可降解芐嘧磺隆的短桿菌屬(Brevibacteriumsp.)BH菌株，在2535℃條件下、pH7.07.5時(shí)，培養(yǎng)7 d對(duì)100 mg/L BSM的降解率為29.4%。張松柏等從農(nóng)藥廠工業(yè)廢水和污泥中富集分離到光合細(xì)菌PSB07-6，鑒定為Rhodopseudomonaspalustris(沼澤紅假單胞菌)，在pH6.5的光合細(xì)菌培養(yǎng)基中30℃條件下培養(yǎng)5 d后，對(duì)350 mg/L芐嘧磺隆的降解率為25.03%。Lin等分離到BacillusmegateriumL1菌株，培養(yǎng)84 h對(duì)50 mg/L BSM的降解率為12.8%。Xiong等篩選到的Rhodococcussp.BX2菌株對(duì)20 mg/L BSM的7d降解率為92%。除此外，彭星星等分離篩選到的芐嘧磺隆降解真菌Aspergillussp.BP-H-01菌株，最適pH 7.5、28℃條件下對(duì)25 mg/L BSM的2 d降解率為84.5%。Peng等分離到Penicilliumpinophilum(嗜松青霉)BP-H-02菌株，在30℃條件下置于pH 6.5的培養(yǎng)基中，對(duì)50 mg/L BSM的60 h降解率為87%。以上報(bào)道的芐嘧磺隆降解菌株最適pH值均為中性或酸性條件。Sabadie等的研究表明BSM在土壤中主要經(jīng)化學(xué)水解和生物學(xué)降解進(jìn)行，其化學(xué)水解是pH依賴性的、在酸性或中性條件下(pH8.0)可通過脲橋斷裂水解形成穩(wěn)定的嘧啶胺和苯甲磺酰氨。本研究獲得的Klebsiellapneumoniae75B菌株在堿性條件下(pH 7.09.0)生長(zhǎng)良好，更有利于堿性土壤中生物降解的進(jìn)行。另外，該菌株的溫度適應(yīng)范圍(2638℃)更廣、對(duì)50 mg/L芐嘧磺隆的5 d降解率可達(dá)74.11%，培養(yǎng)至10 d時(shí)幾乎可完全降解，是一株降解效果優(yōu)良的菌株，對(duì)于該菌株的進(jìn)一步研究可為其用于污染土壤的生物修復(fù)奠定基礎(chǔ)。
Klebsiella屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，在環(huán)境中廣泛存在，其分離株或具有內(nèi)生性固氮作用、或者是條件性致病菌。Klebsiellapneumoniae是可定殖和感染多種動(dòng)植物的克雷伯氏菌屬成員。早期的研究表明該菌為條件性致病菌，可致人肺炎及奶牛乳腺炎。近年來發(fā)現(xiàn)Klebsiellapneumoniae分離株具有代謝多樣性，占據(jù)了不同類型的環(huán)境生態(tài)位；菌種的不同分離株也表現(xiàn)出遺傳和表型的多樣性。多位研究者發(fā)現(xiàn)在玉米或水稻中有該種微生物內(nèi)生定殖并具有固氮活性，而且玉米分離株較臨床分離株的毒力更低。Klebsiellapneumoniae不同地區(qū)分離株還被報(bào)道具有降解石油、降解苯并芘和芘，可利用單寧酸等多種能力。本研究中分離到的Klebsiellapneumoniae菌株被首次發(fā)現(xiàn)還具有降解芐嘧磺隆的能力，也充分表明了該種微生物具有一定的環(huán)境生物修復(fù)潛能。
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