不同光照、pH條件對(duì)血紅密孔菌培養(yǎng)過(guò)程中生物量、總抗氧化能力的影響（一）
藥用真菌是很重要的中藥來(lái)源之一，具有降血脂、抗腫瘤、改善機(jī)體免疫力等多種功效。真菌能夠在其生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生大量的生理活性物質(zhì)，主要包含黃酮、多酚、多糖、有機(jī)酸、甾體、萜類與多肽等，具有很好的抗腫瘤、抗氧化等活性，且毒副作用較低。紅平菇多糖能夠通過(guò)增強(qiáng)抗氧化酶活性、清除肝臟中釋放的自由基阻斷氧化鏈反應(yīng)來(lái)緩解由四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷，保護(hù)肝臟；研究發(fā)現(xiàn)香菇菌絲體多糖可通過(guò)提高機(jī)體抗氧化能力來(lái)緩解由苯酚誘導(dǎo)的大鼠口腔潰瘍，減輕其炎性反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，銀耳多糖可通過(guò)降低血小板數(shù)目，減少黏附率，起到抗血栓的作用。靈芝三萜化合物能夠通過(guò)激活ERK和JNK促分裂原激活蛋白激酶，促使肝癌細(xì)胞HuH-7凋亡。血紅密孔菌(Pycnoporussanguineus)是擔(dān)子菌綱、多孔菌科、密孔菌屬的一種白腐真菌。具有殺滅細(xì)菌、抑制腫瘤、消炎止血等作用。研究發(fā)現(xiàn)血紅密孔菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物色素具有抑制革蘭陽(yáng)性菌的作用；當(dāng)液態(tài)培養(yǎng)血紅密孔菌色素質(zhì)量濃度為4.32μg/mL時(shí)，抑菌率高達(dá)98%。密孔菌可作為食品應(yīng)用于保健品的開(kāi)發(fā)，也可用于治療皮膚損傷。目前對(duì)血紅密孔菌的研究多集中在木質(zhì)纖維素類原料生物轉(zhuǎn)化方面，而培養(yǎng)條件(光照和pH)對(duì)血紅密孔菌生長(zhǎng)及抗氧化活性影響的研究并不多見(jiàn)。不同的培養(yǎng)條件尤其是光照和pH，對(duì)真菌生長(zhǎng)，抗氧化能力都有較大影響。連續(xù)兩周的光照條件及pH 9時(shí)對(duì)真菌多酚含量的影響較大，抗氧化能力達(dá)到最高，約為其他條件的1.2倍和1.5倍。24 h光照條件下，忍冬纖孔菌生物量較低，但DPPH自由基的清除能力相對(duì)較高，約為其他條件的0.6倍和1.2倍；在初始培養(yǎng)液pH分別為5及3條件下，菌絲體生物量和提取物活性均達(dá)到最高，最高可達(dá)其他條件的1.5倍和3倍；光照條件下樺褐孔菌生物量比黑暗中的低，而DPPH自由基清除活性則比黑暗條件下高。生物抗氧化能力主要是清除自由基，目前自由基清除能力分析的常用方法是DPPH法，該法也是評(píng)價(jià)物質(zhì)體外抗氧化活性的重要方法。本研究通過(guò)對(duì)血紅密孔菌的培養(yǎng)，對(duì)不同光照和pH條件下血紅密孔菌的生物量、DPPH自由基清除能力和總抗氧化能力進(jìn)行分析，為進(jìn)一步優(yōu)化血紅密孔菌培養(yǎng)條件提供參考，也支持了進(jìn)一步探究其藥理藥效。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1菌種來(lái)源血紅密孔菌(Pycnoporussanguineus)，購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心(ACCC 51180)。
1.1.2培養(yǎng)基(g/L)①固體PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200，葡萄糖20，KH2PO41.5，MgSO4·7H2O 1,瓊脂20,水1 000 mL，pH自然。②液體PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200，葡萄糖20，KH2PO41.5，MgSO4·7H2O 1,水1 000 mL，pH根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要調(diào)節(jié)。
1.2方法
1.2.1菌種活化與培養(yǎng)菌種接種于固體PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)7 d后轉(zhuǎn)接到液體PDA培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)，28℃、150 r/min培養(yǎng)7 d，取出留作后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。
1.2.2不同光照與pH條件培養(yǎng)①光照對(duì)血紅密孔菌的影響：用滅菌后的勻漿器打碎活化后的菌體發(fā)酵液，經(jīng)充分振蕩后以2%的接種量接種到250 mL錐形瓶中(含有100 mL液體PDA培養(yǎng)基，pH自然)，設(shè)置14 d黑暗(D)、14 d光照(L)和1 d黑暗、1 d光照(DL)交替3種光照條件，設(shè)3個(gè)平行，每2 d取樣，于恒溫?fù)u床28℃、150 r/min培養(yǎng)。②pH對(duì)血紅密孔菌的影響：用滅菌后的勻漿器打碎活化后的菌體液，經(jīng)充分振蕩后以2%的接種量接種到100 mL液體PDA培養(yǎng)基(已分別調(diào)節(jié)pH至3.0、5.0、7.0、9.0)，28℃、150 r/min黑暗條件下培養(yǎng)14 d，設(shè)3個(gè)平行，每隔2 d取樣檢測(cè)。
1.2.3菌體及上清收集每2 d取樣，8 000 r/min離心15 min；收集菌體60℃烘干至恒重，稱量記錄不同培養(yǎng)條件下菌體生物量，生物量(g/L)=菌絲體干重(g)/發(fā)酵液體積(L)；收集上清液用于DPPH自由基清除能力檢測(cè)、胞外T-AOC含量檢測(cè)。
1.2.4總抗氧化能力檢測(cè)采用南京建成生物工程研究所試劑盒測(cè)定，具體操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。待測(cè)樣品分為測(cè)定管與對(duì)照管，測(cè)定管中依次加入相關(guān)試劑及待測(cè)樣品；對(duì)照管中除不加入待測(cè)樣品外，其余同測(cè)定管一致。37℃充分反應(yīng)30 min后，各加入顯色劑(對(duì)照管中另加入待測(cè)樣品)分別充分混勻；于520 nm波長(zhǎng)下，測(cè)定各管吸光度值?？偪寡趸芰τ?jì)算公式：
總抗氧化能力(U/mL)=
1.2.5 DPPH自由基清除能力檢測(cè)收集不同培養(yǎng)條件下的上清各100μL于96孔板中，并向每孔中加入100μL 2.0×10-4mol/L的DPPH溶液，混勻后室溫避光放置30 min，于517 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的吸光值，清除率計(jì)算公式：
清除率(%)=(1-(Ai-Aj)/A0)×100%
式中：Ai為DPPH溶液與樣品混合后溶液的吸光值；Aj為樣品溶液的吸光值；A0為DPPH溶液的吸光值。
1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所得的結(jié)果數(shù)值均以平均值及標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05時(shí)為差異顯著。
2結(jié)果與分析
2.1不同光照及pH條件對(duì)血紅密孔菌生長(zhǎng)過(guò)程中生物量變化的影響
2.1.1光照不同光照培養(yǎng)條件下，血紅密孔菌生物量均基本呈上升趨勢(shì)(圖1)。14 d光照條件下，生物量先上升至第8天為2.68 g/L，于第10天有所下降，后又升至2.92 g/L(第12天)，后于第14天略降至2.28 g/L;1 d光照1 d黑暗交替條件下，生物量于第2～12天略有升高，并在第14天最終達(dá)到2.94 g/L;14 d黑暗條件下，第2～10天血紅密孔菌的生物量處于緩慢上升狀態(tài)，并于第10天～12天生物量大幅上升，隨后緩慢上升并于第14天達(dá)到最大值，為4.49 g/L。綜上所述，14 d黑暗條件更利于血紅密孔菌的生長(zhǎng)，于第10～14天生長(zhǎng)過(guò)程中，其生物量均明顯高于14 d光照組及14 d光照黑暗交替組且差異顯著。
圖1不同光照條件對(duì)血紅密孔菌生物量的影響
2.1.2 pH值在血紅密孔菌的生長(zhǎng)過(guò)程中，不同pH條件對(duì)其生物量的影響較大(圖2)。當(dāng)pH為3時(shí)，生物量于第4天達(dá)到最大值4.89 g/L，后續(xù)保持基本平穩(wěn)狀態(tài)；當(dāng)pH為5時(shí)，生物量一直上升至第10天，達(dá)最大值7.12 g/L，隨后略有下降，第14天下降至6.49 g/L；當(dāng)pH為7時(shí)，生物量從第2～4天保持平穩(wěn)，從第4～12天處于上升狀態(tài)，于第12天達(dá)最大值5.70 g/L，隨后有所下降，降至5.48 g/L；當(dāng)pH為9時(shí)，生物量從第2～14天基本保持升高，并于第14天達(dá)最大值6.19 g/L。綜上所述，pH為5時(shí)，血紅密孔菌的生物量增長(zhǎng)最大且后期(第8～14天)較其余3組增長(zhǎng)明顯。因此，pH 5更適于該菌的生長(zhǎng)。
圖2不同pH條件對(duì)血紅密孔菌培養(yǎng)過(guò)程中生物量的影響
不同光照、pH條件對(duì)血紅密孔菌培養(yǎng)過(guò)程中生物量、總抗氧化能力的影響（一）
不同光照、pH條件對(duì)血紅密孔菌培養(yǎng)過(guò)程中生物量、總抗氧化能力的影響（二）
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