Zn2+、Cd2+、Cry1Ac蛋白單獨(dú)及聯(lián)合暴露對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的毒性作用（三）
2.4細(xì)菌ROS活性檢測(cè)
過(guò)量ROS會(huì)造成細(xì)菌氧化損傷，甚至使細(xì)菌活性受到影響。重金屬氧化損傷所產(chǎn)生的ROS可攻擊膜脂，導(dǎo)致膜功能障礙，同時(shí)對(duì)蛋白質(zhì)、DNA和細(xì)胞內(nèi)系統(tǒng)造成損害。圖4為暴露于Zn2+和Cd2+后細(xì)菌體內(nèi)的ROS產(chǎn)生量變化。單一金屬對(duì)細(xì)菌毒性影響的結(jié)果表明：Zn2+濃度從2μg?mL-1增加到20μg?mL-1，E.coli和B.subtilisti產(chǎn)生的ROS變化顯著（P<0.05）。Zn在酶催化反應(yīng)、細(xì)胞代謝、信號(hào)傳遞等生理調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，有助于抑制自由基和ROS的產(chǎn)生，從而可增強(qiáng)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和抗氧化酶的活性。然而過(guò)量的Zn會(huì)起到毒性作用，Zn會(huì)與其他金屬發(fā)生錯(cuò)金屬化阻斷蛋白質(zhì)硫醇表達(dá)，從而引發(fā)基本生物功能的破壞，導(dǎo)致細(xì)胞毒性。Cd2+濃度從2μg?mL-1增加到10μg?mL-1，E.coli和B.subtilisti產(chǎn)生的ROS變化顯著（P<0.05），雖然Cd2+濃度低，但其毒性很高。Cd2+濃度的增加會(huì)誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生過(guò)量的ROS，造成DNA損傷，最后使生物體發(fā)生細(xì)胞凋亡。此外，細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生量的增加可能與金屬引起的抗氧化劑消耗（如谷胱甘肽）有關(guān)。直接影響重金屬對(duì)生物體毒性效應(yīng)的不是吸附金屬離子的數(shù)量，而是能夠與酶、蛋白質(zhì)、DNA以及其他細(xì)胞結(jié)構(gòu)的功能基團(tuán)反應(yīng)的離子或分子的數(shù)量。
圖4 Zn2+和Cd2+對(duì)兩種細(xì)菌ROS產(chǎn)生量的影響
細(xì)菌處于Zn2+、Cd2+和Cry1Ac蛋白聯(lián)合暴露的條件下時(shí)，隨著濃度增加兩種菌體ROS的產(chǎn)生量整體呈現(xiàn)先上升后降低趨勢(shì)（圖5），各處理組細(xì)菌ROS產(chǎn)生量都低于對(duì)照組（除了濃度為2μg?mL-1的Zn2+-Cry1Ac復(fù)合體對(duì)E.coli的ROS產(chǎn)生量為103.1%）。如圖5所示，聯(lián)合暴露下E.coli和B.subtilis的ROS產(chǎn)生量呈顯著性變化（P<0.05），這與單獨(dú)金屬離子暴露下細(xì)菌ROS產(chǎn)生量呈現(xiàn)的趨勢(shì)不同，是與金屬離子與色氨酸的吲哚基團(tuán)之間的N配位有關(guān)。在Zn2+-Cry1Ac和Cd2+-Cry1Ac體系中，Zn2+和Cd2+對(duì)吲哚基團(tuán)（色氨酸）中的N具有很強(qiáng)的結(jié)合能力，導(dǎo)致其對(duì)細(xì)菌的氧化損傷降低，從而進(jìn)一步降低金屬毒性。Zn2+-Cry1Ac處理比Cd2+-Cry1Ac處理下E.coli體內(nèi)ROS產(chǎn)生量多：一方面，Cd2+會(huì)誘導(dǎo)細(xì)菌防御機(jī)制響應(yīng)誘導(dǎo)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）和金屬硫蛋白（MT）等幾種保護(hù)酶的升高，這些酶能夠拮抗Cd的毒性，更多的抗氧化酶能夠清除生物體中Cd脅迫產(chǎn)生的超氧陰離子和過(guò)氧化氫等。另一方面，用純Cd2+溶液（如CdCl2）進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，其對(duì)細(xì)菌的毒性大于Zn2+溶液。Cd2+-Cry1Ac較Zn2+-Cry1A對(duì)細(xì)菌的毒性低，這是因?yàn)镃d2+與其他物質(zhì)（例如各種離子或有機(jī)成分）之間的相互作用通常會(huì)改變Cd2+的毒性，此時(shí)Zn2+-Cry1A聯(lián)合暴露對(duì)細(xì)菌毒性更強(qiáng)。
圖5 Zn2+、Cd2+和Cry1Ac蛋白聯(lián)合暴露對(duì)兩種細(xì)菌ROS產(chǎn)生量的影響
2.5發(fā)光細(xì)菌急性毒性檢驗(yàn)
發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光抑制率反映重金屬對(duì)細(xì)菌的毒性效應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)Zn濃度大于1.2 mg?L-1時(shí)對(duì)發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度有明顯抑制作用，Cd和Pb濃度改變對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響不顯著。如圖6所示，不同濃度Zn2+、Cd2+均對(duì)Vibrio fischeri產(chǎn)生抑制，且抑制率隨金屬濃度增加而變大（P<0.05）。Zn2+濃度從2μg?mL-1增加到20μg?mL-1，Zn2+對(duì)Vibrio fischeri的發(fā)光抑制率由41%增加到85%；Cd2+濃度從2μg?mL-1增加到10μg?mL-1，Cd2+對(duì)Vibrio fischeri的發(fā)光抑制率由39%增加到61%；即不同濃度金屬離子的毒性效果不同，濃度愈高，毒性愈強(qiáng)。相同濃度下Zn2+對(duì)Vibrio fischeri的抑制率大于Cd2+，即Zn2+對(duì)Vibrio fischeri的毒性較大。青海弧菌Q67和費(fèi)氏弧菌的毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明Zn2+的毒性大于Cd2+，可能是Zn2+與硫的親和力強(qiáng)于Cd2+，導(dǎo)致其對(duì)發(fā)光細(xì)菌毒性較大。
圖6不同濃度Zn2+、Cd2+、Cry1Ac蛋白及復(fù)合體系對(duì)費(fèi)氏弧菌生長(zhǎng)抑制率的影響曲線
從圖6（c）中可以看出，各處理對(duì)細(xì)菌作用15 min后，隨著Cry1Ac蛋白濃度升高，Vibrio fischeri的發(fā)光抑制率由負(fù)到正，這是由于Cry1Ac蛋白本身含有具有內(nèi)源熒光特性的色氨酸（Trp）、苯丙氨酸（Phe）和酪氨酸（Tyr），其中最主要的是色氨酸。具有熒光特性的Cry1Ac蛋白與Vibrio fischeri結(jié)合導(dǎo)致熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，因此抑制率為負(fù)，隨著Cry1Ac蛋白濃度的增加，抑制率逐漸增大，但不會(huì)對(duì)細(xì)菌造成毒性影響。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因Bt稻草（Cry1Ab蛋白）在淹水條件下分解的Cry1Ab蛋白對(duì)細(xì)菌不會(huì)造成毒害作用，即Bt蛋白不會(huì)對(duì)土壤微生物構(gòu)成危害。
Zn2+、Cd2+與Cry1Ac聯(lián)合暴露下Vibrio fischeri的生長(zhǎng)抑制率也由負(fù)到正，這是由于發(fā)出熒光的Cry1Ac蛋白和Zn2+、Cd2+結(jié)合使自身熒光強(qiáng)度有所減弱。研究表明，具有熒光特性的Cry1Ac蛋白與不發(fā)光的金屬離子相互作用，降低了Vibrio fischeri產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度，這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。仇愛(ài)鋒等的研究表明隨著Cd2+和Cu2+對(duì)費(fèi)氏弧菌暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，菌體細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，毒性增大。本研究中，隨著濃度的升高各處理對(duì)Vibrio fischeri的抑制效果增強(qiáng)，相同濃度下各處理對(duì)Vibrio fischeri的抑制效果表現(xiàn)為Zn2+>Cd2+>Zn2+-Cry1Ac>Cd2+-Cry1Ac>Cry1Ac。
3、結(jié)論
（1）高濃度的Zn2+、Cd2+會(huì)對(duì)E.coli、B.subtilis生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，細(xì)菌存活率也顯著降低（P<0.05），兩種細(xì)菌相比B.subtilis的耐受性強(qiáng)于E.coli。
（2）Cry1Ac蛋白不會(huì)對(duì)細(xì)菌造成毒性損傷；二元體系聯(lián)合暴露時(shí)Zn2+、Cd2+均與Cry1Ac蛋白（吲哚基團(tuán)）結(jié)合，使得Zn2+、Cd2+對(duì)兩種細(xì)菌的毒性降低。
（3）兩種細(xì)菌活性氧產(chǎn)生量表明Zn2+和Cd2+對(duì)E.coli和B.subtilis造成了嚴(yán)重?fù)p傷，Zn2+-Cry1Ac和Cd2+-Cry1Ac聯(lián)合暴露對(duì)E.coli和B.subtilis沒(méi)有造成嚴(yán)重?fù)p傷。
（4）Zn2+、Cd2+及Cry1Ac蛋白濃度增加對(duì)Vibrio fischeri的發(fā)光強(qiáng)度抑制增強(qiáng)，相同濃度下各處理體系的發(fā)光抑制效果為Zn2+>Cd2+>Zn2+-Cry1Ac>Cd2+-Cry1Ac>Cry1Ac。
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