朱鹮細胞系的建立、體外生長特征、性染色體的熒光原位雜交鑒定（三）
圖2朱鹮細胞的平滑肌肌動蛋白抗體免疫熒光染色
2.2朱鹮細胞生長特性分析
利用MTT法,我們測定了連續培養7 d的不同傳代數的朱鹮細胞生長情況。圖3為5、10、20和25代朱鹮細胞的生長曲線。體外培養的朱鹮細胞表現出了典型的“潛伏期—對數生長期—停滯期”的生長模式。在細胞傳代過程中,我們發現不同代數細胞的增殖能力和形成單層的時間有所不同。傳代數＜10的細胞,輪廓清晰、立體感強且增殖能力強,3 d即可形成致密單層;傳代數＞15的細胞,形成單層的時間逐漸延長,到20代以后,細胞增殖能力明顯減慢,5 d才可形成單層;傳代數＞25的細胞,形態扁大,顯現衰老特征且不能再形成單層。因此,我們所建立的朱鹮細胞系為有限細胞系,為保證細胞的旺盛生長力,需在建系早期多凍存傳代數低的細胞,且要避免長時間連續傳代細胞。
圖3不同傳代數的朱鹮細胞生長曲線
2.3細胞遺傳學分析
為證實我們所建立的細胞系確實來源于朱鹮,排除培養過程中可能發生的細胞交叉污染,我們制備了這兩株培養朱鹮細胞的中期染色體,并進行了以下細胞遺傳學分析。
染色體數目和形態鳥類染色體所具有的大量微小染色體在使用Giemsa染液染色時著色較淺(圖4A),在染色體分散不理想時不易計數。為了準確計數微小染色體,我們采用能使所有鳥類染色體均勻著色的熒光染料碘化丙啶(propidium iodine,PI,Amresco)對所制備的中期染色體進行染色(圖4B)。對100個中期分裂相的計數結果表明,細胞的染色體眾數為2n=68,包括性染色體在內有10對大染色體,其余為微小染色體。我們的結果與Liu et al（1992)報道的朱鹮核型分析結果一致,證明我們所建立的細胞系確實來源于朱鹮。
帶型分析目前,有關朱鹮顯帶染色體未見報道。在本研究中,我們首次進行了朱鹮染色體Ag帶、C帶(圖4C,D)和G帶(圖5)顯示。在所觀察的20個細胞中,銀染的核仁組織者區(nucleolar organizer region,NOR)分布在一對微小染色體上(圖4C,箭頭所示)。C帶(異染色質)主要分布在多數大染色體的著絲粒區域,微小染色體多為C帶陽性,表明其微小染色體含有豐富的異染色質。W染色體和Z染色體的長臂末端均為C帶陽性(圖4D,箭頭所示)。朱鹮的染色體C帶與已報道的家雞的染色體C帶相似(Pollock&Fechheimer,1981)。圖5為朱鹮的G帶核型圖,染色體排列方式參照Liu et al(1992)的報道,按染色體的相對長度,從長到短進行排列。G帶分析結果表明,除雌性性染色體為異配的ZW以及雄性性染色體為同配的ZZ外,雌、雄個體的G帶核型一致;Z染色體為中著絲粒染色體,相對長度僅次于第5號染色體;W染色體長度約為Z染色體的一半。這些結果與Liu et al(1992)的報道一致。雖然可以根據性染色體為同配或異配來鑒別鳥類的性別,但鳥類的W染色體較小,長度與一些較小的常染色體相當,因此,在常規染色的分裂相中,僅根據外形,很難準確鑒別W染色體(Shields,1982)。對于朱鹮W染色體的形態,Takasi&Sasaki（1974)的報道為亞端著絲粒染色體,Liu et al（1992)認為是中著絲粒染色體,而我們的G帶核型分析支持其為亞端著絲粒染色體（圖5)。
圖4不同染色和顯帶的朱鹮染色體
圖5朱鹮的G帶核型
朱鹮性染色體鑒別在以前的研究中,通過流式分選,我們已獲得了石鸻(B.oedicnemus,鸻形目)的Z和W染色體特異探針(Nie et al,2009)。為準確鑒別朱鹮的性染色體,特別是W染色體,我們利用石鸻的Z和W染色體特異探針,分別與雄、雌性朱鹮的中期分裂相進行熒光原位雜交(圖6A,B)。在雄性朱鹮的中期分裂相中,石鸻的Z染色體探針涂染了一對中著絲粒染色體(圖6A),即Z染色體,與核型分析確定的Z染色體一致。在雌性朱鹮的中期分裂相中,石鸻的W染色體探針涂染了一條較小的亞端著絲粒染色體(圖6B),直接證明W染色體是一條較小的亞端著絲粒染色體(圖6C)。另外,石鸻的Z和W染色體探針分別在朱鹮的一對微小染色體和Z染色體長臂的末端有交叉雜交的信號。這種交叉雜交的信號,在以石鸻的Z和W染色體探針與家雞的中期分裂相進行熒光原位雜交的實驗中也曾被檢測到(Nie et al,2009),表明石鸻的Z和W染色體探針中包含有與被雜交的染色體同源的序列,這些同源的序列可能是重復序列。
圖6熒光原位雜交示例
近期,西安交通大學和華大基因已合作完成了朱鹮全基因組序列圖譜繪制。朱鹮體細胞系的成功建立,不僅保存了這一珍稀瀕危鳥類的遺傳資源,也為后續開展其基因定位和其它生物學研究提供了實驗材料。在本研究中所建立的朱鹮體細胞培養的方法,也可以用于其他鳥類的體細胞系建立和保藏。
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