微生物生長曲線監(jiān)測系統(tǒng)&光學(xué)延時(shí)顯微鏡用于快速評估吸濕性食品樣品中的微生物質(zhì)量
研究背景：本研究探索了一種基于光學(xué)延時(shí)顯微鏡（Optical Time-Lapse Microscopy）的快速微生物檢測技術(shù)，用于評估吸濕性食品樣品（如卡拉膠）中的微生物質(zhì)量。這項(xiàng)研究由丹麥技術(shù)大學(xué)國家食品研究所和IntuBio ApS合作完成，旨在解決傳統(tǒng)微生物檢測方法在處理吸濕性食品時(shí)面臨的挑戰(zhàn)，并提供一種更快速、準(zhǔn)確的替代方案。卡拉膠是一種從紅藻中提取的水溶性膠體，廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中作為凝膠劑、增稠劑或穩(wěn)定劑。
然而，其吸濕性特性使得傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)法在檢測微生物污染時(shí)面臨諸多問題，如樣品膨脹、形成凝膠團(tuán)塊、堵塞移液管以及在瓊脂平板上形成氣泡和雜質(zhì)，導(dǎo)致計(jì)數(shù)困難且容易出錯(cuò)。此外，傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)法需要長達(dá)72小時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間，這對于食品制造商快速釋放產(chǎn)品和提高食品安全性提出了挑戰(zhàn)。為了解決這些問題，研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種基于光學(xué)延時(shí)顯微鏡的檢測方法，利用IntuGrow系統(tǒng)對微型平板（mini agar plates）進(jìn)行實(shí)時(shí)成像和分析。該方法通過將卡拉膠粉末夾在兩層瓊脂之間，避免了樣品膨脹對檢測的影響，并通過DELAY算法對圖像進(jìn)行處理，消除了背景噪聲和卡拉膠膨脹帶來的干擾。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法能夠在12-20小時(shí)內(nèi)完成檢測，相比傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)法（72小時(shí)）大大縮短了檢測時(shí)間。研究團(tuán)隊(duì)對14種不同污染水平的卡拉膠樣品進(jìn)行了測試，結(jié)果顯示，光學(xué)延時(shí)顯微鏡法與傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)法之間存在幾乎完美的相關(guān)性（Deming回歸斜率為0.96），但存在-0.33 log CFU/g的偏差。這表明，盡管光學(xué)延時(shí)顯微鏡法能夠快速、準(zhǔn)確地檢測微生物，但在某些情況下可能會低估微生物數(shù)量。此外該方法的檢測限為50 CFU/g，略高于傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)法（40 CFU/g），但其快速檢測的優(yōu)勢使其在工業(yè)應(yīng)用中具有巨大的潛力。總體而言，本研究成功開發(fā)了一種適用于吸濕性食品的快速微生物檢測技術(shù)，能夠顯著縮短檢測時(shí)間，提高檢測效率和準(zhǔn)確性。未來，該技術(shù)有望在食品工業(yè)中得到廣泛應(yīng)用，尤其是在需要快速評估微生物質(zhì)量的場景中。然而，該技術(shù)在工業(yè)環(huán)境中的可重復(fù)性和操作簡便性仍需進(jìn)一步驗(yàn)證，以確保其在實(shí)際應(yīng)用中的可靠性和穩(wěn)定性。
丹麥Biosense微生物生長曲線監(jiān)測系統(tǒng)的應(yīng)用
將3D光學(xué)顯微鏡掃描系統(tǒng)oCelloScope置于培養(yǎng)箱（35°C）中，并將裝有準(zhǔn)備好的微型瓊脂板的6孔板加載到系統(tǒng)中，以使用IntuGrow軟件（Biosense Solution，丹麥）進(jìn)行延時(shí)圖像生長分析。按照先前報(bào)道的研究）經(jīng)過一些修改。簡而言之，在20 h內(nèi)每小時(shí)生成每個(gè)孔的5670張圖像。應(yīng)用的技術(shù)設(shè)置為2 ms的照明時(shí)間、1.4 mm×1.05 mm的視場（FOV），聚焦深度為10μm，光學(xué)分辨率為1.35μm，光學(xué)放大倍數(shù)為4.0。成像從下方進(jìn)行，由于各種角叉菜膠類型的吸濕能力，與在瓊脂頂部觀察到的不規(guī)則和變化的瓊脂高度相比，在微型瓊脂平板內(nèi)獲得了瓊脂更平坦和光滑的一面。傾斜的（相對于水平面6.25°）光軸可以掃描微型瓊脂板并形成圖像堆棧。單個(gè)z平面的投影z堆棧圖像是通過組合傾斜圖像生成的。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論
使用了光學(xué)延時(shí)顯微鏡技術(shù)（IntuGrow）在快速評估吸濕性食品（如卡拉膠）中的微生物質(zhì)量方面具有顯著潛力。與傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)法相比，該技術(shù)能夠?qū)z測時(shí)間從72小時(shí)縮短至12-20小時(shí)，大大提高了檢測效率。Deming回歸分析顯示，光學(xué)延時(shí)顯微鏡法與傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)法之間存在幾乎完美的相關(guān)性（斜率為0.96），但存在-0.33 log CFU/g的偏差，表明傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)法可能高估了微生物數(shù)量，而IntuGrow技術(shù)可能低估了微生物數(shù)量。這種偏差可能與卡拉膠的特性（如膨脹和抑制微生物生長）以及兩種方法的樣品制備方式有關(guān)。盡管IntuGrow技術(shù)在檢測限（50 CFU/g）上略高于傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)法（40 CFU/g），但其快速檢測的優(yōu)勢使其在工業(yè)應(yīng)用中具有明顯吸引力，尤其是在需要快速釋放產(chǎn)品以減少召回風(fēng)險(xiǎn)和提高食品安全性的情況下。此外該技術(shù)通過“夾心法”樣品制備和DELAY算法，成功解決了卡拉膠膨脹和背景噪聲的問題，能夠有效區(qū)分微生物微菌落和卡拉膠引起的假陽性信號。
圖1、均勻100×稀釋的角叉菜膠樣品的瓊脂接種問題。A/B：角叉菜膠形成凝膠狀結(jié)構(gòu)和氣泡，可能會被誤解并算作菌落。這些通常存在于培養(yǎng)皿底部附近，而菌落則出現(xiàn)在瓊脂的整個(gè)瓊脂中。C/D：角叉菜膠會產(chǎn)生渾濁和渾濁的背景以及帶有小顆粒和氣泡的干擾結(jié)構(gòu)，在早期孵育（24-48小時(shí)）和計(jì)數(shù)（72小時(shí)）期間，根據(jù)樣品微生物群的不同，這些小顆粒和氣泡可能會被誤認(rèn)為是小菌落。E/F：在5%的瓊脂平板中觀察到芽孢桿菌屬的蜂群菌落，這使得這些平板無法計(jì)數(shù)或具有挑戰(zhàn)性。
圖2、使用Biosense微生物動態(tài)堿性系統(tǒng)的IntuGrow DELAY算法處理原始顯微鏡圖像之前（A）和（B）之前（B）基于圖像的微生物微菌落計(jì)數(shù)。微生物微菌落（用黃色圓圈標(biāo)記的示例）在處理后的圖片中顯示為黑點(diǎn)，其中基于延時(shí)處理的DELAY算法將未生長的角叉菜膠碎片和氣泡作為白點(diǎn)或灰色隕石坑（示例用紅色虛線圓圈標(biāo)記）。
圖3、Biosense微生物動態(tài)監(jiān)測系統(tǒng)基于圖像的微生物計(jì)數(shù)允許在芽孢桿菌屬蜂群開始覆蓋其他菌落之前對微生物菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。黃色圓圈表示菌落，由于蜂群，使用傳統(tǒng)的終點(diǎn)計(jì)數(shù)不會對其進(jìn)行計(jì)數(shù)。
圖4、在IntuGrow處理（D、E、F）具有高、中和低微生物污染水平（從左到右）的原始圖像（A、B、C）后，對角叉菜膠樣品進(jìn)行基于圖像的計(jì)數(shù)。檢測到的CFU數(shù)量和計(jì)算的CFU/g濃度如圖D、E和F所示。
圖5、14個(gè)角叉菜膠樣品的細(xì)胞濃度（log CFU/g）比較。對原始商業(yè)角叉菜膠樣品（A、B、C、D、E、F）以及通過角叉菜膠樣品稀釋（/稀釋因子）或加標(biāo)（s）獲得的微生物濃度降低或增加的樣品進(jìn)行了測試。所有樣品均在獨(dú)立測試中進(jìn)行了兩次重復(fù)測試。A）所有測試的角叉菜膠樣品和重復(fù)中的細(xì)胞濃度。B）為每種角叉菜膠類型獲得的平均細(xì)胞濃度的Demings回歸，具有完美的（x=y）相關(guān)線以進(jìn)行視覺比較。C）比較IntuGrow和平板計(jì)數(shù)時(shí)平均CFU濃度的殘差圖。
總結(jié)
在食品行業(yè)，獲得結(jié)果的時(shí)間對于更快地放行產(chǎn)品、最大限度地減少召回、緩解微生物污染問題以及最終實(shí)現(xiàn)食品安全至關(guān)重要。角叉菜膠是從紅海藻（Rhodophyta）中分離出來的，由于其吸濕特性，它被用作各種食品和飲料中的膠凝劑、增稠劑、紋理劑或穩(wěn)定劑。目前，標(biāo)準(zhǔn)的行業(yè)平板計(jì)數(shù)方法需要在與熔融瓊脂混合之前將樣品稀釋100倍，以便在企業(yè)對企業(yè)運(yùn)輸之前評估角叉菜膠樣品中的微生物污染水平。然而，即使在這種稀釋下，角叉菜膠也會膨脹、形成團(tuán)塊、堵塞移液器，并在瓊脂平板上留下厚厚的凝膠結(jié)構(gòu)、氣泡和碎屑，導(dǎo)致微生物計(jì)數(shù)具有挑戰(zhàn)性并容易出現(xiàn)人為錯(cuò)誤。
在這里，研究人員首次報(bào)道了由Biosense微生物生長動態(tài)監(jiān)測系統(tǒng)內(nèi)的IntuGrow解決方案監(jiān)測的微型瓊脂板的應(yīng)用，以評估具有挑戰(zhàn)性的食品成分中的微生物質(zhì)量。在不稀釋食品樣品的情況下，將角叉菜膠粉末撒在兩層平板計(jì)數(shù)瓊脂之間，以在12-20小時(shí)內(nèi)對細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，而通過傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)需要72小時(shí)。開發(fā)了一種用于光學(xué)延時(shí)顯微鏡（ocelloScope微生物動態(tài)監(jiān)測系統(tǒng)）的DELAY算法，并將其添加到IntuGrow分析軟件中，以通過使用以前的圖像對背景進(jìn)行歸一化來抑制腫脹的影響并增強(qiáng)對生長微生物菌落存在的檢測。延時(shí)顯微鏡基于圖像的監(jiān)測可以從角叉菜膠樣品中獲得結(jié)果，而由于細(xì)菌成群結(jié)隊(duì)，傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)無法獲得的結(jié)果。
兩種方法之間的比較顯示0.96的近乎完美的Demings斜率，而觀察到的-0.33 log CFU/g偏差表明IntuGrow計(jì)數(shù)低于傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)。這可能是由于卡拉膠人工制品在后一個(gè)板塊中被算作菌落。IntuGrow能夠?qū)遣娌四z等具有挑戰(zhàn)性的食品成分中的細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，這意味著該技術(shù)應(yīng)該易于應(yīng)用于易于稀釋的樣品或非親水膠體粉末。光學(xué)延時(shí)顯微鏡技術(shù)（Biosense微生物動態(tài)監(jiān)測系統(tǒng)）在快速評估吸濕性食品中的微生物質(zhì)量方面表現(xiàn)出色，未來有望在食品工業(yè)中得到廣泛應(yīng)用。其快速檢測能力不僅能夠提高生產(chǎn)效率，還能為食品安全管理提供更及時(shí)的決策支持。
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