25種天然植物精油對藍莓致病菌生長曲線、抑制作用（三）
2結果與分析
2.1病原菌菌落形態學觀察與鑒定
經過純化后的藍莓病原菌離體以及活體形態如圖1所示，共分離出4種形態的病原菌，分別命名為I、II、III、IV。病原菌I菌絲為白色，分生孢子梗為典型的掃帚狀，且彼此緊貼。孢子為暗綠色，呈圓形或橢圓形，直徑為3μm左右，分生孢子成熟后極易脫落。在PDA培養基上產孢量高，正面質地為絨毛狀，有時生長狀態呈放射狀，顏色為青綠色或者深綠色，背面產黃褐色色素。侵染藍莓后白色菌絲在傷口軟腐處蔓延并伴隨大量青色孢子產生，根據其形態特征與青霉屬特征相似度極高，推測病原菌I為青霉屬真菌。
圖1病原菌離體以及活體形態
病原菌II菌絲為白色，壁厚且光滑，頂部形成球形頂囊，頂囊上覆蓋一層梗基和小梗，分生孢子由小梗上產出。分生孢子為黑褐色，呈圓形或近圓形，直徑為4μm左右。在PDA培養基上最先蔓延的是一層微乳白的分泌物，產孢量高，正面質地為絨狀，顏色為黑褐色或者棕褐色，背面白色或微黃。侵染藍莓后藍莓果肉軟腐，有黑色霉層覆蓋并伴隨汁液流出，根據其形態特征與曲霉屬中的黑曲霉相似，推測病原菌II為曲霉屬真菌。
病原菌III菌絲為褐色，有隔膜。分生孢子為棕褐色梭形或倒棒形，具有橫隔或者縱膈，形成壁磚狀結構。在PDA培養基上產孢量低，正面為褐綠色或深綠色絮狀，背面為褐色或黑褐色。侵染藍莓后傷口處有灰綠色霉層覆蓋，偶爾伴隨無色汁水流出，根據其形態特征與鏈格孢屬相似度高，推測病原菌III為鏈格孢屬真菌。
病原菌IV菌絲為白色，呈絮狀或者叢卷毛狀，纖細且密集。分生孢子為淺粉色，呈棒形。在PDA培養基上正面最先蔓延的是膜狀物，膜上附著著菌絲，部分中期正面為粉色，背面為橘紅色，后期正面會變成淺紫色，背面為深紫色。侵染藍莓后傷口處附著白色絮狀菌絲并伴隨粉色孢子產生。
2.2病原菌的致病力分析
將純化過的菌株制備菌懸液并回接至藍莓果實上，放入培養箱中培養3～5 d。如圖2所示，病原菌I侵染的藍莓果實在第2天傷口及周圍發生軟腐，偶有凹陷，能明顯觀察到菌絲蔓延，果實出現青綠色霉層，發病猛烈，在侵染第2天時發病率就達到了100%。病原菌II侵染的藍莓果實在第2天整果內部逐漸軟腐，伴隨紅色汁水流出以及菌絲蔓延，果實傷口出現黑褐色霉層，發病猛烈，在侵染第3天時發病率達到100%。病原菌III侵染的藍莓果實在第3天傷口周圍開始出現凹陷，伴隨無色汁水流出，菌絲蔓延速度稍慢，果實傷口出現灰綠色霉層，在侵染第3天發病率達到100%。病原菌IV侵染的藍莓果實，菌絲大多數在傷口處生長，病斑為白色絮狀，傷口不發生明顯擴張，雖然在侵染第3天時發病率也達到了100%，但致病癥狀較前3種菌輕。綜合致病力實驗結果，4種致病菌的致病力排序為病原菌I＞病原菌II＞病原菌III＞病原菌IV。
圖2 4種病原菌侵染藍莓果實的癥狀（A）和發病率（B）
2.3系統發育樹構建
利用ITS、BenA和CaM基因進一步對4種致病菌進行分子生物學鑒定，結果如圖3所示。病原菌I、II分別與皮落青霉（Penicillium crustosum）、塔賓曲霉（Aspergillus tubingensis）進化關系最近，病原菌III的ITS與鏈格孢菌（Alternaria alternata）的ITS序列同源性最高，生長狀態也符合形態學上對鏈格孢菌的描述，病原菌IV的BenA序列與串珠鐮刀菌（Fusarium verticillioides）的BenA序列同源性最高。結合形態學分析，確定分離出來的病原菌I為皮落青霉，病原菌II為塔賓曲霉，病原菌III為鏈格孢菌，病原菌IV為串珠鐮刀菌。考慮到病原菌IV的致病力較弱，因此后續部分實驗只針對藍莓優勢致病病原菌I、II和III展開。
圖3 4種藍莓致病菌的系統發育樹
2.4病原菌生長條件分析
2.4.1最適生長溫度
如圖4所示，在4℃條件培養時病原菌II完全不長，病原菌I和III仍能保持緩慢生長。隨著培養溫度的升高，3種菌的生長速度均增加，其中病原菌I和III的生長速度在25℃時達到最高，溫度繼續增加則生長速度降低，且溫度越高抑制效果越明顯，最適溫度在25℃左右。在4～28℃范圍，病原菌II的生長速度隨培養溫度升高持續增加，之后溫度再增加，病原菌仍保持較快的生長速度，表現出較好的溫度耐受性，最適生長溫度在28℃左右。
圖4 3種病原菌在不同溫度條件下的生長情況
2.4.2生長曲線
采用非線性擬合的方法能夠更清晰地了解到病原菌I、II和III的生長情況，結果如圖5所示。6～48 h和48～72 h分別是病原菌I的生長對數期和生長穩定期；12～36 h和36～72 h分別是病原菌II的生長對數期和生長穩定期；0～36、36～66 h和66～72 h分別是病原菌III的生長調整期、生長對數期和生長穩定期。
圖5病原菌I（A）、病原菌II（B）和病原菌III（C）的生長曲線
2.4.3孢子萌發率
如圖6所示，3種病原菌在培養6 h時均已萌發，其中病原菌I的孢子萌發率最高（33%），病原菌II次之（19.67%），病原菌III最低（15.59%）。隨著培養時間的延長，3種病原菌的孢子萌發率持續增加，且均在12 h完全萌發。
圖6 3種病原菌的孢子萌發率
2.5植物精油體外抑菌效果分析
2.5.1 25種植物精油的作用效果
由于驗證的植物精油種類較多，以致病力最強的病原菌I（皮落青霉）為研究對象，篩選作用效果較好的植物精油。如表1所示，在25種植物精油中，濃度為2μL/mL的芥末精油、牡荊精油、花椒精油、茉莉精油、依蘭精油、細辛精油、艾草精油、續斷精油、丁香羅勒精油、紅景天精油能完全抑制病原菌I的生長，山蒼子精油對病原菌I的抑菌濃度為1.5μL/mL，艾草精油和快樂鼠尾草精油對病原菌I的抑菌濃度為2μL/mL，其他精油對病原菌I的抑菌濃度均高于2μL/mL。
表1 25種植物精油體外對皮落青霉生長的影響
注：25種精油均為精油＋吐溫＋PDB＋皮落青霉；＋.有菌絲生長；-.無菌絲生長。下同。
選取抑菌濃度小于2μL/mL的植物精油對病原菌II（塔賓曲霉）進行作用效果檢測，發現芥末精油、丁香羅勒精油對病原菌II的抑菌濃度均為1μL/mL，茉莉精油、續斷精油、山蒼子精油、紅景天精油對病原菌II的抑菌濃度均為2μL/mL（表2）。
表2 12種植物精油體外對塔賓曲霉生長的影響
2.5.2精油的有效抑菌濃度分析
根據96孔板初篩出的精油種類、作用濃度（≤2μL/mL）以及剔除不易被人接受的芥末精油，最終篩選出茉莉精油、丁香羅勒精油、續斷精油、山蒼子精油和紅景天精油5種精油進行平板驗證實驗。如圖7所示，2μL/mL的茉莉精油、丁香精油、山蒼子精油和紅景天精油能完全抑制病原菌I、II、III和IV的生長，2μL/mL的續斷精油可完全抑制病原菌I、II和III的生長，對IV的抑菌率為97%。這5種精油對4種病原菌均具有高效的體外抑菌效果。
圖7 5種植物精油對4種病原菌生長的影響
進一步測定了5種植物精油對4種病原菌的MIC和MFC，結果如表3所示。5種精油對病原菌I的MIC以及MFC為丁香羅勒精油＝山蒼子精油＜茉莉精油＝續斷精油＝紅景天精油；對病原菌II的MIC以及MFC為山蒼子精油＜丁香羅勒精油＜茉莉精油＝續斷精油＝紅景天精油；對病原菌III的MIC以及MFC為山蒼子精油＜丁香羅勒精油＜茉莉精油＝紅景天精油＜續斷精油；對病原菌IV的MIC以及MFC為山蒼子精油＜茉莉精油＝丁香羅勒精油＜紅景天精油＜續斷精油。5種精油對4種菌的MIC范圍在0.5～2μL/mL，MFC范圍在1～4μL/mL，且每種精油對每種菌的MFC/MIC均不超過2倍。山蒼子精油和丁香羅勒精油對病原菌I、II、III皆表現出較好的抑菌效果，MIC均不超過1μL/mL，MFC均不超過2μL/mL。
表3 5種植物精油對4種致病菌的MIC和MFC
2.6 5種植物精油對接種皮落青霉的藍莓果實病害發生的影響
如圖8所示，對照組藍莓果實在接種皮落青霉的第2天，傷口出現明顯病斑和霉層，隨著貯藏時間的延長，病斑逐漸擴大。在第6天時，果實發病率為100%，病斑布滿藍莓果實，果實發生嚴重腐爛。相比對照組，茉莉精油和山蒼子精油處理組的藍莓果實青霉病在貯藏期間得到了較好的控制，在貯藏結束時果實發病情況和表面的霉層仍然較少。在貯藏第6天，茉莉精油、丁香羅勒精油、續斷精油、山蒼子精油和紅景天精油處理組的發病率分別為72.5%、100%、97.5%、15%和97.5%，丁香羅勒精油、續斷精油和紅景天精油在藍莓果實上沒有表現出明顯的病害控制效果。山蒼子精油和茉莉精油熏蒸對藍莓青霉病發生有較好的控制作用，其中山蒼子精油的作用效果最佳，茉莉精油次之。
圖8 5種植物精油對接種皮落青霉的藍莓果實病害發生的影響
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