基于可培養(yǎng)技術(shù)的古象牙病害微生物分離鑒定與抑菌劑篩選評(píng)價(jià)（二）
1.2.4抑菌實(shí)驗(yàn)
?抑菌劑的選擇:為盡可能減少抑菌劑對(duì)古象牙文物本體的影響，選用以下抑菌劑分析其抑菌效果(表1)。
?細(xì)菌抑菌效果分析:采用楊盛智等關(guān)于最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)的測(cè)定方法對(duì)抑菌劑的濃度進(jìn)行篩選。采用二倍稀釋法配置濃度分別為20 480、10 240、5 120、2 560、1 280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5 mg/L的抑菌劑母液備用。按照1:9的比例將各濃度母液分別加入滅菌且降溫至50°C的MHA培養(yǎng)基中，即稀釋10倍，使得培養(yǎng)基中抑菌劑濃度分別為2048、1024、512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 mg/L。采用oCelloScope 微生物生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)量?jī)x將濁度為0.5麥?zhǔn)媳葷岬墓┰嚲臃N到含有不同濃度抑菌劑的MHA表面，每組3個(gè)重復(fù)，接種后的平板置35°C恒溫培養(yǎng)24 h后，觀察培養(yǎng)皿上供試菌株生長(zhǎng)的情況，以0 mg/L抑菌劑瓊脂平板為參照，判斷抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低濃度，確定最小抑菌濃度。
?真菌抑菌效果分析:參考細(xì)菌MIC的測(cè)定方法，對(duì)抑制象牙表面真菌生長(zhǎng)的抑菌劑進(jìn)行篩選。同樣采用二倍稀釋法配置不同濃度的抑菌劑母液，制備含有400、200、100、50 mg/L濃度的制霉菌素、三氯生抑菌劑的PDA平板；苯扎氯銨制備抑菌濃度梯度為8000、4000、2000、1000 mg/L；苯并咪唑制備抑菌濃度梯度為2000、1000 mg/L。將直徑為6 mm的真菌菌餅接種于含有不同濃度抑菌劑的PDA培養(yǎng)皿中，每組3個(gè)重復(fù)，對(duì)照組為不含任何抑菌劑的普通PDA培養(yǎng)皿。將接種后的培養(yǎng)皿置于25°C恒溫培養(yǎng)5 d。觀察真菌生長(zhǎng)狀況，將抑制所有真菌生長(zhǎng)的最低濃度作為最小抑菌濃度。
1.2.5復(fù)合抑菌劑構(gòu)建及效果評(píng)估
為提高抑菌效果，以前期篩選出的各抑菌劑能夠抑制所有細(xì)菌或真菌生長(zhǎng)的最小抑菌濃度為基礎(chǔ)，采用二倍稀釋法稀釋后再進(jìn)行兩兩組合配置復(fù)配抑菌液，并評(píng)估復(fù)配抑菌劑的抑制效果，若復(fù)配液能達(dá)到完全抑菌效果，進(jìn)一步通過(guò)二倍稀釋法再次降低各抑菌劑的復(fù)配濃度，直至篩選出各復(fù)配抑菌劑能夠抑制所有真菌或細(xì)菌生長(zhǎng)的最小復(fù)配濃度。
1.2.6數(shù)據(jù)分析
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS20.0軟件處理。
2結(jié)果與分析
2.1古象牙殘片表面微生物觀察
采用超景深顯微鏡對(duì)古象牙殘片樣品表面微生物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示樣品XY51-1和XY51-2表面主要生長(zhǎng)著白色如棉絮狀的菌絲，具有典型的霉菌特征；樣品XY52-1表面產(chǎn)生了大量類(lèi)似于細(xì)菌生物膜的紅色黏性物質(zhì)，無(wú)明顯菌絲結(jié)構(gòu)。
2.2古象牙表面可培養(yǎng)微生物分離及形態(tài)觀察
針對(duì)不同古象牙殘片表面微生物生長(zhǎng)情況，采用TSA分離古象牙殘片XY52-1表面附著的微生物，采用PDA培養(yǎng)基分離古象牙殘片XY51-1和XY51-2表面絮狀微生物。如圖3所示，從不同古象牙殘片表面分離出菌落形態(tài)存在明顯差異的菌株，表明導(dǎo)致殘片表面形成的病害現(xiàn)象是由不同微生物共同作用的結(jié)果。
從古象牙殘片表面共分離獲得33株菌，其中有4株菌在TSA培養(yǎng)基上呈現(xiàn)出乳白色、淡黃色、橘紅色的菌落顏色，菌落大小不一，表面濕潤(rùn)光滑、邊緣整齊等典型細(xì)菌菌落特征(圖4)。菌株B6菌落較小，表面光滑，邊緣整齊，菌落顏色呈橘紅色，易挑取，革蘭氏染色陽(yáng)性，短桿狀，無(wú)芽孢，菌體大小為0.5μm x 0.9μm；菌株B12菌落較小、呈圓形凸?fàn)睿吘壵R，表面光滑，菌落顏色呈黃色，易挑取，革蘭氏染色陽(yáng)性，短桿狀，無(wú)芽孢，菌體大小為0.6μm x 1.0μm；菌株B13菌落中間向內(nèi)凹陷，表面光滑，邊緣整齊，易挑取，菌落顏色呈乳白色，革蘭氏染色陰性，菌體為桿狀，菌體大小為1μm x 2μm，菌體光滑無(wú)鞭毛；菌株B106號(hào)菌落較小，表面光滑，邊緣整齊，易挑取，菌落顏色呈乳白色，革蘭氏染色陰性，短桿狀，菌體大小1.3μm x 1.5μm。
29株菌菌落主要為褐色、白色、青灰色、紅色等，菌落大小不一，疏松或緊密，呈絮狀、絨毛狀、短發(fā)狀等典型真菌的菌落形態(tài)，顯微形態(tài)觀察表明，真菌菌體主要為菌絲分支形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)或產(chǎn)生分生孢子(圖4)。分離菌株中A21單菌落為白色棉絮狀菌絲，與象牙表面的白色霉變物相似，顯微觀察可見(jiàn)分生孢子，孢子聚集呈手指狀，菌絲有隔；分離菌株中A4單菌落表面干燥呈現(xiàn)絨狀，菌落由內(nèi)向外為黃色、白色、紅色放射性生長(zhǎng)，菌落扁平，菌落底部能分泌紅色物質(zhì)，將其染色后置于顯微鏡下觀察可見(jiàn)分生孢子聚集呈鏈狀，菌絲有隔。
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