制藥廢水生化處理過程中硝化菌分離篩選、生長曲線的測定（二）
1.4硝化菌的篩選
將分離得到的硝化菌分別接種到富集培養基中，在30℃、180 r/min的搖床中培養24 h。將初篩選出的硝化菌（OD600約為1.0）按5%的接種量接種于液體培養基中，在30℃，180 r/min搖床中培養。分別在培養0 h、24 h、48 h、72 h后取樣檢測總氮（TN）、氨氮、硝態氮和亞硝態氮濃度，選取脫氮效果良好的硝化菌。
1.5菌種鑒定
1.5.1形態學鑒定
1.5.2 16 S rDNA分子鑒定
按SK8255（細菌）試劑盒操作說明提取基因組DNA。采用16S rDNA通用引物：27F（5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）；7F（5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’）和1540R（5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’）進行PCR擴增。硝化菌由上海生工生物完成16S rDNA分子鑒定。將16S rDNA序列結果在核糖體數據庫（http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp）中進行比對，搜索相似性較高的模式硝化菌及其基因序列。
1.6生長曲線的測定
目標菌液（OD600約1.0）按5%體積比接種于液體培養基中，在30℃、180 r/min搖床中培養，定期取樣測定菌液在600 nm處吸收值，繪制生長曲線。
2結果與分析
2.1好氧活性污泥微生物結構豐度分析
如圖1所示，硫酸新霉素制藥廢水的好氧活性污泥中優勢菌為變形菌門（47.85%），可能存在4種變形菌：β-變形菌（Betaproteobacteria），22.46%；γ-變形菌（Gammaproteobacteria），12.01%；ɑ-變形菌（Alphaproteobacteria），8.84%；δ-變形菌（Deltaproteobacteria），3.97%。
圖1活性污泥中的微生物群落分類學系統樹狀圖
2.2硝化細菌的篩選
2.3細菌分離鑒定
2.3.1形態學觀察
3株細菌的主要形態學特點見表1。
表1硝化菌的菌落形態特征
2.3.2不同硝化菌對氨氮、亞硝態氮、總氮降解效果
圖2不同硝化菌對總氮、氨氮、亞硝態氮和硝態氮的去除效果
2.3.3優勢硝化菌A1的染色鑒定
對目標硝化菌A1進行染色，結果顯示為革蘭氏陰性菌，呈短桿或球桿狀，見圖3。
圖3硝化菌A1在顯微鏡下觀察的形態結果
2.3.4菌種鑒定
對目標硝化菌A1進行16S rDNA測序分析，發現與泛養副球菌（Paracoccus pantotrophus）DSM 2944的1號染色體完整序列相似性水平達到100%。結合硝化菌的形態學特征及菌種鑒定結果，確定其為泛養副球菌（Paracoccus pantotrophus），見表2。
表2基于目標硝化菌16S rDNA序列測定結果
2.4硝化菌A1生長曲線測定
由圖4可知，在培養初期細菌生長速率緩慢，12 h后進入對數生長期，48 h左右到達穩定期。
圖4硝化菌A1的生長曲線
3結論
本實驗對硫酸新霉素制藥廢水處理中的好氧活性污泥的微生物菌群結構采用宏基因組技術進行了解析。研究結果表明，從門水平而言，好氧污泥中細菌類型主要為變形菌門（豐度47.85%）和擬桿菌門（豐度11.77%），其中硝化螺菌屬豐度為0.75%；通過宏基應組測序對主要差異物種進行解析，好氧污泥中豐度最高的變形菌門可能存在著4種變形菌屬，分別為α-變形菌、丙型變形菌、β-變形菌、δ-變形菌；從污泥樣本中分離篩選出3株具有硝化能力的硝化菌，其中硝化菌A1具有較好的硝化能力，經鑒定為泛養副球菌（Paracoccus pantotrophus），與污泥中高豐度菌門結果一致，A1除有明顯脫氮效果外，還表現出反硝化功能。該研究發現對硫酸新霉素制藥廢水處理研究具有重要意義，今后將結合實際對硝化菌脫氮條件進行優化，為制藥廢水脫氮工程實踐應用提供依據及經驗。
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