鴿源大腸桿菌分離株對13種抗菌藥物耐藥現狀研究（二）
1.4耐藥基因檢測
?菌株DNA模板的制備:參照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取大腸桿菌分離株DNA，于-20℃條件下保存備用。
?引物設計與合成:根據參考文獻設計16種E.coli耐藥基因引物，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列如下：
?喹諾酮類:
?qnrS:F:5'-ACGACATTCGTCAACTGCAA-3',R:5'-TAAATTGGCACCCTGTAGGC-3',片段長度417 bp,退火溫度55℃
?oqxA:F:5'-GATCAGTCAGTGGGATAGTTT-3',R:5'-TACTCGGCGTTAACTGATTA-3',片段長度670 bp,退火溫度55℃
?β-內酰胺類:
?blaTEM:F:5'-CAGCGGTAAGATCCTTGAGA-3',R:5'-ACTCCCCGTCGTGTAGATAA-3',片段長度734 bp,退火溫度54℃
?blaSHV:F:5'-TTATCTCCCTGTTAGCCACC-3',R:5'-GATTTGCTGATTTCGCTCGG-3',片段長度860 bp,退火溫度57℃
?blaCTX-M:F:5'-CGCTTTGCGATGTGCAG-3',R:5'-ACCGCGATATCGTTGGT-3',片段長度550 bp,退火溫度54℃
?blaNDM:F:5'-GGTTTGGCGATCTGGTTTTC-3',R:5'-CGGAATGGCTCATCACGATC-3',片段長度621 bp,退火溫度52℃
?blaIMP:F:5'-GGAATAGAGTGGCTTAAYTCTC-3',R:5'-CGGAATGGCTCATCACGATC-3',片段長度332 bp,退火溫度52℃
?blaMIR:F:5'-TCGGTAAAGCCGATGTTGCGG-3',R:5'-CTTCCACTGCGGCTGCCAGTT-3',片段長度302 bp,退火溫度64℃
?blaVIM:F:5'-GATGGTGTTTGGTCGCATA-3',R:5'-CGAATGCGCAGCACCAG-3',片段長度390 bp,退火溫度52℃
?blaDHA:F:5'-AACTTTCACAGGTGTGCTGGGT-3',R:5'-CCGTACGCATACTGGCTTTGC-3',片段長度405 bp,退火溫度64℃
?氨基糖苷類:
?aacC2:F:5'-ACTGTGATGGGATACGCGTC-3',R:5'-CTCCGTCAGCGTTTCAGCTA-3',片段長度482 bp,退火溫度58℃
?aacC4:F:5'-CTTCAGGATGGCAAGTTGGT-3',R:5'-TCATCTCGTTCTCCGCTCAT-3',片段長度286 bp,退火溫度58℃
?磺胺類:
?sul1:F:5'-CTTCGATGAGAGCCGGCGGC-3',R:5'-GCAAGGCGGAAACCCGCGCC-3',片段長度238 bp,退火溫度58℃
?sul2:F:5'-GCGCTCAAGGCAGATGGCATT-3',R:5'-GCGTTTGATACCGGCACCCGT-3',片段長度722 bp,退火溫度50℃
?多黏菌素類:
?mcr-1:F:5'-CGGTCAGTCCGTTTGTTC-3',R:5'-CTTGGTCGGTCTGTAGGG-3',片段長度309 bp,退火溫度55℃
?mcr-2:F:5'-TGTTGCTTGTGCCGATTGGA-3',R:5'-AGATGGTATTGTTGGTTGCTG-3',片段長度567 bp,退火溫度65℃
?耐藥基因PCR擴增:以提取的DNA為模板進行耐藥基因的檢測。反應體系(25.0μL)為:2xFast Taq plus PCR Master 12.5μL，上下游引物各1.0μL，DNA模板1.0μL，ddH2O 9.5μL。反應條件為:95℃預變性5 min;94℃變性30s，表1中相應退火溫度退火1 min，72℃延伸1 min，30個循環;72℃延伸10 min。反應完成后，取5.0μL PCR擴增產物置1%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，于凝膠成像系統中拍照。
2結果(Results)
2.1細菌的分離與鑒定
在麥康凱瓊脂培養基上共分離純化出150株疑似大腸桿菌的單菌落，可見邊緣整齊、表面光滑濕潤、中間隆起的紅色圓形菌落（描述如下）。
疑似菌株經MALDI TOF MS質譜儀分析共鑒定出120株大腸桿菌。
2.2耐藥表型檢測
120株大腸桿菌分離株對13種抗菌藥物的藥敏試驗結果如下：
?MIC分布和敏感性總結:
?環丙沙星(CIP):敏感率17.50%(21/120),耐藥率65.00%(78/120),中介率17.50%(21/120)
?氨芐西林(AMP):敏感率45.83%(55/120),耐藥率54.17%(65/120)
?阿莫西林克拉維酸(AMC):敏感率53.33%(64/120),耐藥率46.67%(56/120)
?頭孢噻肟(CTX):敏感率51.67%(62/120),耐藥率35.00%(42/120),中介率13.33%(16/120)
?頭孢他啶(CAZ):敏感率44.17%(53/120),耐藥率30.00%(36/120),中介率25.83%(31/120)
?亞胺培南(IPM):敏感率52.50%(63/120),耐藥率15.83%(19/120),中介率31.67%(38/120)
?阿米卡星(AMI):敏感率78.33%(94/120),耐藥率15.83%(19/120),中介率5.83%(7/120)
?慶大霉素(GEN):敏感率50.83%(61/120),耐藥率30.83%(37/120),中介率18.33%(22/120)
?甲氧芐啶(TMP):敏感率52.50%(63/120),耐藥率32.50%(39/120),中介率15.00%(18/120)
?磺胺甲噁唑(SMZ):敏感率46.67%(56/120),耐藥率44.17%(53/120),中介率9.17%(11/120)
?黏菌素(CL):敏感率78.33%(94/120),耐藥率21.67%(26/120)
?氯霉素(CHL):敏感率71.67%(86/120),耐藥率28.33%(34/120)
?磷霉素(FOS):敏感率92.50%(111/120),耐藥率7.50%(9/120)
通過對大腸桿菌分離株的多重耐藥情況分析發現，共有74株(占分離株61.67%)對3種及以上抗菌藥物耐藥，最多可以對8種抗菌藥物耐藥，其中對4種抗菌藥物耐藥的菌株數量最多，有27株(占分離株22.50%)。多重耐藥結果基于表3內容總結如下：
?多重耐藥菌株分布:
?耐3種藥物菌株:20株
?耐4種藥物菌株:27株
?耐5種藥物菌株:17株
?耐6種藥物菌株:7株
?耐7種藥物菌株:2株
?耐8種藥物菌株:1株
描述多重耐藥占比的圖片嵌入如下。
2.3耐藥基因檢測
120株大腸桿菌分離株的耐藥基因檢測統計結果如下：
?耐藥基因檢出率:
?qnrS:91.7%(110/120)
?oqxA:0(0/120)
?aacC2:0(0/120)
?aacC4:27.5%(33/120)
?sul1:2.1%(25/120)
?sul2:0(0/120)
?mcr-1:0(0/120)
?mcr-2:0(0/120)
?blaTEM:87.5%(105/120)
?blaSHV:0(0/120)
?blaCTX-M:30.8%(37/120)
?blaNDM:0(0/120)
?blaIMP:0(0/120)
?blaMIR:0(0/120)
?blaVIM:3.3%(4/120)
?blaDHA:0(0/120)
2.4耐藥表型和耐藥基因型分析
由耐藥表型和基因型檢測結果可知，大腸桿菌分離株對β-內酰胺類抗菌藥物AMP、AMC、CTX、CAZ和IPM的耐藥率為15.83%-54.17%，與其耐藥基因檢出率結果3.3%-87.5%基本相符，尤其是對CTX的耐藥率(35.00%)與頭孢噻肟酶CTX-M的基因blaCTX-M檢出率(30.8%)一致；對氨基糖苷類抗菌藥物AMI、GEN的耐藥率為15.83%-30.83%，與其耐藥基因檢出率結果27.5%基本一致；對喹諾酮類抗菌藥物CIP的耐藥率為65.00%，低于其耐藥基因檢出率91.7%；對磺胺類抗菌藥物TMP、SMZ的耐藥率為32.50%-44.17%，高于其耐藥基因檢出率2.1%；CL耐藥率同樣高于其耐藥基因檢出率。
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