發根農桿菌Ri質粒構建燈盞花發根最優的培養體系（三）
2.2菌液濃度對發根誘導率的影響
在農桿菌介導的遺傳轉化中，菌液濃度是否適當是轉化成功與否的關鍵問題之一。若菌液濃度過低，可能會使農桿菌無法有效侵染葉盤而導致轉化效率過低；若菌液濃度過高，則可能造成侵染過度或菌體產生代謝物對植物細胞造成傷害而導致葉盤死亡。此外，如果濃度過高，可能使農桿菌在共培養培養基上也會生長過旺，導致后續的脫菌培養無法進行。
試驗中發現當菌液濃度的OD600值為0.4時，誘導率普遍較低，甚至未能成功誘導出陽性發根；菌液濃度在OD600值為0.8時雖然轉化率較高，但外植體死亡率或染菌率也高，發根后續脫菌培養過程難以抑制農桿菌生長，造成無法液培。而OD600為0.6時，整體上誘導率相對較高，外植體死亡率較低，且基本不影響后續的脫菌培養及液培。因此綜合取OD600=0.6為最佳菌液濃度。
2.3浸染時間對發根誘導率的影響
農桿菌菌液浸染葉盤的時間對轉化率有很大影響。若浸染時間太短，可能農桿菌未能成功侵入葉盤細胞而導致轉化失敗；若浸染時間太長，則農桿菌容易對葉盤造成過度傷害而使葉盤黃化死亡。
試驗中發現當菌液濃度較低時，浸染時間越長，則整體上誘導率越高，但葉盤死亡率或染菌率也隨之增高；菌液濃度較高時，浸染時間在10 min以內，誘導率隨浸染時間的增加而整體呈增加的趨勢，但浸染時間達15 min時，則因葉盤大量黃化死亡而導致誘導率直線下降。因此，綜合取浸染時間為10 min最佳。
2.4共培養時間對發根誘導率的影響
浸染后共培養的目的，是使葉盤表面的農桿菌充分侵入細胞。因此，共培養時間也是影響誘導率的重要因素。試驗表明，菌液濃度較低，浸染時間較短時，0～3 d內，共培養時間越長，誘導率基本就越高，但同樣存在隨共培養時間增加，葉盤死亡率和染菌率也增高的問題；而菌液濃度較高，浸染時間較長時，共培養時間在0～2 d時，誘導率整體呈增長趨勢，但超過2 d，則轉化率不會再顯著升高，甚至反而會因為過度生長的農桿菌抑制植物細胞的正常生長，造成葉盤死亡率急劇升高，或者因脫菌不完全而導致無法液培。因此，共培養時間以2 d為最好。
2.5不同液體培養基對發根生長速率的影響
發根脫菌完全后，轉移到液體培養基中進行擴大培養。在上述4種不同的液體培養基中，發根生長速率不同，總體上是B5>1/2MS≈1/2B5>MS。在含200 mL B5液體培養基的250 mL錐形瓶中，發根整個生長周期為60～70 d，其中前3周，發根生長速率極慢，基本看不到明顯的生長現象，第4周開始表現出較快的生長速率，在第5～7周生長速率達到最快，在第8～9周以后生長基本進入停滯期，10周之后發根開始變硬，部分根尖開始褐化。不同培養基生長速率比較如圖3。
圖3發根在不同培養基中生長速率
3結論與討論
本研究利用發根農桿菌C58C1菌株侵染燈盞花葉片，成功誘導出毛狀根。同時，通過對菌液濃度、浸染時間和共培養時間3個影響因素的試驗，優化了燈盞花發根的誘導條件。
結果顯示農桿菌菌液濃度直接影響發根誘導效率，燈盞花發根誘導的最佳菌液濃度為OD600=0.6，李景濱等的研究發現，金鐵鎖(Psammosilenetunicoides)毛狀根誘導的最佳菌液濃度為OD600=0.8；農桿菌對葉盤的浸染時間是遺傳轉化中的重要因素，燈盞花最佳浸染時間為10 min，黃偉劍等的研究表明，廣藿香(Pogostemoncablin)毛狀根誘導的最佳浸染時間為25 min；共培養時間的長短也與轉化效率密切相關，適于燈盞花發根誘導的共培養時間為2 d，劉連旺等的研究顯示，適于地黃(Rehmanniaglutinosa)毛狀根誘導的最佳共培養時間為4 d。由此可見不同植物對農桿菌敏感性不同，因此選擇合適的菌液濃度、浸染時間和共培養時間有助于提高誘導率。另外，燈盞花發根擴大培養的最佳培養基為B5液體培養基。
本研究初步建立了燈盞花發根遺傳轉化體系。隨著對植物中次生代謝途徑了解的深入，基因克隆和高效遺傳轉化系統的發展，利用遺傳代謝工程手段在植物細胞工廠大量生產有藥理活性的次生代謝化合物已成為可能。如果將燈盞花中燈盞乙素代謝途徑中催化速率限制步驟的關鍵酶基因采用代謝工程的方法在燈盞花植物體或發根中過量表達，則理論上也可以提高燈盞乙素的含量。
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