瑞香狼毒葉（斷腸草）對金黃色葡萄球菌和石膏樣毛癬菌生長曲線的影響——材料與方法
目的研究瑞香狼毒葉提取物對常見皮膚表面菌的抑菌活性。方法采用藥敏紙片法和二倍稀釋法測定瑞香狼毒葉提取物對石膏樣毛癬菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用。結果瑞香狼毒葉95%乙醇提取物濃度為100 mg·mL-1時對金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑達12.8 mm，對石膏樣毛癬菌抑菌圈直徑達12.0 mm，二氯甲烷萃取物對金黃色葡萄球菌最低抑制濃度(MIC)為0.25mg·mL-1，對石膏樣毛癬菌MIC為0.50mg·mL-1。結論瑞香狼毒葉提取物對石膏樣毛癬菌和金黃色葡萄球菌均有抑制活性，其中對金黃色葡萄球菌抑制活性較強。
狼毒是一種不常用的中藥，其味苦辛、性平、有毒，瑞香狼毒是狼毒的正名，為瑞香科狼毒屬植物瑞香狼毒的干燥根，又名斷腸草。歷代本草中狼毒是以瑞香科植物瑞香狼毒根收載入藥，具有清熱解毒、消腫、瀉炎癥、止潰瘍、祛腐生肌功能。瑞香狼毒根提取物可以治療實體瘤、肺結核和牛皮癬，據最新報道還有抗病毒的作用，尤其是抗人免疫缺陷病毒的作用。而瑞香狼毒地上部分莖和葉的化學成分以及生物活性還少見研究。人體皮膚表面菌主要由金黃色葡萄球菌和真菌石膏樣毛癬菌為代表，筆者以上述兩種人體皮膚表面菌為研究對象，對瑞香狼毒葉提取物進行抑菌活性研究，發現瑞香狼毒葉可抑制人皮膚表面菌，報道如下。
1材料與方法
1.1藥材
瑞香狼毒葉采自四川甘孜州的天然草場，將采回的瑞香狼毒葉陰干、粉碎備用(四川大學生命科學學院侯太平教授鑒定為正品瑞香狼毒);金黃色葡萄球菌、石膏樣毛癬菌(均由四川成都檢驗檢疫局提供標準菌株)。將菌株沾取微量的菌苔接種于培養皿中培養，將培養好的典型單菌落轉種于滅菌的冷卻液體培養基中，利用搖床37℃培養成原液。用滅菌水把原菌液稀釋成濃度10-1、10-2、10-3……。每個濃度取2mL與培養基30mL混勻倒3個平板，27℃培養箱中培養，選生長菌落數在30～300個稀釋濃度作為實驗菌液，金黃色葡萄球菌實驗菌液為10-7，石膏樣毛癬菌實驗菌液為10-4。
1.2儀器
RE52-98旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠制造);W201B恒溫水浴鍋(上海申順生物科技有限公司);SHB-3循環水多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司);802型超凈工作臺(天津醫療凈化設備廠);隔水式電熱恒溫培養箱(上海躍進醫療器械廠);手提式壓力蒸汽消毒器(成都勝利醫用設備廠);游標卡尺(上海精美量具廠);生物顯微鏡(上海光學儀器廠);Ws70-1型紅外線快速干燥器(上海銀屏儀器儀表有限公司)。
1.3瑞香狼毒樣品提取
稱取適量瑞香狼毒葉粉，用95%乙醇、無水乙醇回流提取，每種溶劑提取3次，合并3次提取液，利用旋轉蒸發儀進行濃縮至膏狀物，得到95%乙醇提取物和無水乙醇提取物。將上述抑菌活性高的95%乙醇提取物，利用石油醚、二氯甲烷、丙酮、甲醇進行依次萃取。萃取在分液漏斗中進行，萃取溶劑用量按照少量多次進行。每次萃取完畢將萃取液分離出來，再將剩下的進行第二次萃取，以此類推，將多次萃取液合并濃縮至膏狀物。分別得到石油醚提取物、二氯甲烷提取物、丙酮提取物、甲醇提取物。
1.4乙醇粗提物的抑菌活性(藥敏紙片法)
將溶解均勻的提取物用純化水稀釋為100，40，16，6.4 mg·m L-14個濃度，以不加藥而加入樣品溶解劑的培養液作為空白對照。將濃度為10-7金黃色葡萄球菌菌液接種在牛肉膏蛋白胨瓊脂平板上，濃度為10-4石膏樣毛癬菌菌液接種在沙氏平板上。將滅菌冷卻好的直徑為6 mm圓紙片在稀釋好的提取樣品中浸泡透后取出，酒精燈上微烘后，依次貼于平板的位置3個，同時貼上空白對照。將貼好紙片的培養皿輕放在37℃恒溫培養箱中培養，細菌培養24 h，真菌27℃培養5 d，然后利用游標卡尺測定抑菌圈直徑。每個樣品濃度平行做3次取平均值。
1.5萃取物的抑菌活性
最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)的測定:將滅菌好的裝有培養液試管排列在試管架上，第一管的裝量6 mL、其余都為3 mL。加入藥液并稀釋:于第一支試管加入原藥液1 g，混勻后吸取3.0 mL加入第二管中，同法依次稀釋試管，最后一管棄去3.0 mL，使之成為遞減系列濃度。并同時設對照組。趁熱將試管放斜面，待培養液凝固后接入菌液0.1 mL，放于培養箱中培養，金黃色葡萄球菌37℃培養24 h后觀察結果，石膏樣毛癬菌27℃培養5 d后觀察結果。從無菌生長的各管中找出最低藥物濃度的試管，該管的藥物濃度，即MIC。最低殺菌濃度(minimal bactericidal concentration，MBC)測定:待測定完MIC后，用接種環挑取無菌生長的試管上的培養物移種至不含樣品的斜面上，培養1～3 d后觀察有無菌落生長，未見菌落生長的試管所對應的濃度即為最低殺菌濃度。
1.6二氯甲烷樣品對兩種菌處理后鏡檢
將樣品制成濃度為2.5 mg·m L-1(10倍MIC)含藥平板，待平板在無菌室冷卻后取直徑為6 mm的石膏樣毛癬菌菌碟倒貼在藥平板上，同時設空白對照，27℃培養5 d后400倍顯微鏡下觀察菌絲形態變化。將樣品稀釋成濃度為2.5 mg·m L-1(10倍MIC)的含藥培養液，取10-7金黃色葡萄球菌菌液接種于含藥培養液中，同時設空白對照，37℃水浴振蕩培養24 h，取菌液0.01 mL滴加在平板上，37℃培養24 h，挑取平板上的菌落在400倍顯微鏡下觀察細菌形態變化。
1.7二氯甲烷樣品對真菌和細菌的生長曲線的影響
細菌:將樣品稀釋成濃度為2.5 mg·mL-1(10倍MIC)的含藥培養液，接種金黃色葡萄球菌后在搖床上培養，設不加藥為對照。分別于2，4，6，8，10，12，14，16，18，20 h取菌液，稀釋為10-7，取10-7菌液0.01 mL滴加在平板上，培養計數。真菌:將樣品稀釋成濃度為2.5 mg·m L-1(10倍MIC)的含藥平板，設不加藥為對照。培養液平面上均勻放入新生長一致的三個石膏樣毛癬菌的菌餅(直徑6 mm)，將菌餅帶菌絲的一面倒貼培養液表面，然后放入27℃的恒溫培養箱培養，在第1，2，3，4，5，6，7，8，9，10天定時測定平板上菌落的直徑增長，用十字交叉法測每個菌落的兩個直徑，以其平均值代表菌落的直徑。