?鯽魚出血病致病菌嗜水氣單胞菌分離及藥敏試驗結果
鯽魚出血病，一般認為由嗜水氣單胞菌引起，嗜水氣單胞菌感染鯽魚后，在魚體質變差和水質惡化時，在魚體內快速增殖，引起全身出血的癥狀。目前治療出血病主要還是依靠投喂抗生素，但生產中多數養殖戶根據以往經驗使用抗生素，往往效果較差，疾病難以快速治愈，不僅造成養殖戶的損失，還導致鯽魚抗生素超標，影響食品安全。
江蘇大豐某鯽魚精養塘口2018年8月初開始發病，我們取樣分離病原菌并鑒定，對分離的病原菌進行藥敏試驗，以指導養殖戶科學用藥，得到良好的治療效果。
1材料與方法
1.1材料
發病鯽魚2018年8月取自大豐鯽魚精養塘口，200g左右，發病期間出現鯽魚持續死亡，死亡鯽魚體表充血，腹腔內有腹水，初步診斷為鯽魚出血病。試驗用藥敏紙片采購自杭州微生物試劑有限公司；PCRMix、溴化乙錠（EB）、Marker 2000、細菌基因組提取試劑盒采購自北京艾德萊；用于擴增嗜水氣單胞菌的引物由上海生工合成；微生物培養基為腦心浸液培養基（BHI），pH7.4±0.2，采購自OXOID。
1.2致病菌的分離
在超凈工作臺中，用酒精燈灼燒后的接種環從患病魚肝、腎、腦等組織處取樣，涂布在培養基平皿上，30℃培養24小時。挑選優勢菌落接種于斜面培養基，30℃培養24小時，4℃冰箱保存備用。
1.3回歸攻毒實驗
將分離到的致病菌接種到BHI液體培養基中，30℃培養24小時，用生理鹽水將菌液稀釋至108cfu/mL備用。取健康鯽魚60尾，隨機分為兩組，每組30尾。試驗組每尾注射0.2mL菌液，對照組每尾注射0.2mL生理鹽水，飼養10天，每天撈出死亡鯽魚，記錄死亡數量，并對死亡魚進行細菌分離。
1.4致病菌鑒定
按照細菌基因組提取試劑盒說明書，提取從患病鯽魚和攻毒死亡鯽魚上分離到的致病菌DNA，使用嗜水氣單胞菌16S rDNA引物擴增致病菌DNA，正向引物F:GCGGGTACGACGCACCTTGC、逆向引物R:CAGCGTCCAATACCTGGTGTTA，目的片段長度為1091bp，擴增條件為:94℃預變性4 min，94℃變性50 s，59℃退火30 s，72℃延伸60 s，30個循環，最后72℃延伸10 min。PCR擴增后，用添加EB的瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳電壓120V、電泳15分鐘。電泳后使用紫外分析儀觀察結果。
1.5藥敏試驗
采用紙片瓊脂擴散法（K-B法），在超凈工作臺中，將分離到的致病菌用生理鹽水制備成濃度約107～108cfu/mL細菌懸濁液，取100μL均勻涂布于BHI平板上，等待15分鐘左右，使細菌在培養基上定植，然后將不同的藥敏紙片均勻的貼在BHI平板上，30℃培養24小時后，觀察結果，量取抑菌圈直徑，確定致病菌對各藥物的敏感性。
2結果
2.1鯽魚出血病的發病情況
發病塘口位于江蘇大豐，塘口面積90畝，東西朝向，魚塘四周水泥護坡，水深2～2.5m，進排水配套設施完善。2018年8月4日開始，開始每天有十幾尾死魚，三天后突然增加到一百多尾，死魚呈典型的出血病狀況，患病魚腹部，鰭條基部等多處充血，魚眼球突出，解剖后腹腔內有紅色腹水，腸道充血，腸內無食。
2.2回歸攻毒結果
將分離到的致病菌編號為HFJY-1，注射到鯽魚體內后，第2天開始出現死魚，第5天鯽魚全部死亡，死亡率100%，對照組養殖10天未見死亡，攻毒情況見表1。死亡鯽魚表現出與患病鯽魚相同的癥狀，體表、鰭條基部不同程度出血，解剖可見肝臟腫脹充血，有大量腹水。從攻毒死亡鯽魚肝臟分離的致病菌，與HFJY-1的菌落形態一致，編號為HFGD-1。
表1攻毒感染實驗
2.3致病菌的鑒定
從鯽魚的腎和肝上分離到致病菌，其在BHI培養基上生長較快，24小時后可見明顯菌落，菌落呈圓形，邊緣光滑，淡白色。患病鯽魚和攻毒鯽魚致病菌的PCR電泳圖譜中可以看出，HFJY-1和HFGD-1使用嗜水氣單胞菌引物做PCR，在1000bp位置左右出現明顯亮帶，陰性對照未出現條帶，說明這兩株致病菌是嗜水氣單胞菌。
2.4致病菌的藥敏分析
使用水產養殖中常用的氟苯尼考、恩諾沙星、強力霉素、硫酸新霉素、土霉素、紅霉素、復方新諾明和復方磺胺嘧啶等8種抗生素對分離到的兩株致病菌進行藥敏實驗，藥敏實驗結果見表2，結果表明，分離的嗜水氣單胞菌對恩諾沙星、氟苯尼考敏感，紅霉素、強力霉素、硫酸新霉素和復方磺胺嘧啶中度敏感，對復方新諾明和氨芐青霉素耐藥。
3討論
隨著塘租、飼料、漁藥和人工等成本的逐年增加，養殖戶放養密度越來越高，加上缺少科學的疾病防控理念，細菌性疾病暴發越來越頻繁。我國水產養殖從業門檻低，多數的養殖戶缺乏科學的用藥理念，甚至一些漁藥廠家的業務員都不是水產養殖專業，簡單培訓幾天就指導養殖戶，往往為了利益胡亂指導。甚至還有養殖戶使用抗生素進行細菌性疾病的預防，導致各類致病菌產生耐藥性。
鯽魚出血病是危害鯽魚的主要病害之一，隨著多年的抗生素使用，嗜水氣單胞菌已對多種抗生素產生耐藥性。目前，水產上治療細菌性疾病，主要還是通過投喂抗生素外加潑灑，但如何選擇正確的抗生素成為治療成敗的關鍵因素。本文結果表明，嗜水氣單胞菌已對多種抗生素產生不同程度的耐藥性，導致我國水產品抗生素頻頻超標，影響我國水產養殖的健康發展，這是多年來抗生素的亂用濫用造成的。
表2各抗生素藥敏結果
水產從業者在治療細菌性疾病時，應當科學地選擇抗生素，通過藥敏實驗，選擇最優的治療藥物，避免盲目用藥導致疾病無法有效控制。本文發病塘口在藥敏實驗后，外用潑灑復合碘兩次，每次間隔一天，并選擇恩諾沙星作為治療藥物，拌服抗生素后，死亡量大大降低，從每天死亡兩百多條到后來幾條，5天后沒有死魚，沒有死魚后繼續投喂藥餌兩天鞏固治療。在發生細菌性疾病時，不能盲目地使用抗生素，要尊重科學，用科學的理念指導養殖用藥，真正做到科學用藥，減緩致病菌耐藥性的產生。
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