生長曲線測定法和菌落計數法確定YchJ對鼠傷寒沙門菌抗逆能力的影響——摘要
摘要：目的了解ychJ基因及其編碼蛋白YchJ對鼠傷寒沙門菌抗逆能力的影響。方法基于ExPASy ProtParam tool和Clustal Omega對YchJ蛋白性質及氨基酸序列保守性等生物信息學進行分析和預測。采用CRISPRCas9法構建鼠傷寒沙門菌ATCC14028s的ychJ基因敲除株△ychJ,并通過DNA擴增技術進行鑒定。分別對野生株和敲除株進行抗逆功能試驗，通過結晶紫半定量法和剛果紅染色法確定YchJ對沙門菌生物膜形成的影響；采用生長曲線測定法和菌落計數法確定YchJ對沙門菌抗生素耐受能力的影響；利用半固體平板移動法檢測YchJ對沙門菌運動能力的影響。結果YchJ是一種穩定的親水性蛋白，其氨基酸序列相對保守，ychJ基因敲除株構建成功。與野生株的RDAR表型（紅色、干燥和粗糙）相比，該敲除株表現為SAW表型（光滑、白色、濕潤）。經結晶紫染色后，野生株的A570/A600值為0.8345±0.1016,顯著高于ychJ敲除株的0.2633±0.05051.在抗生素耐受性實驗中，低濃度氨芐青霉素或諾氟沙星壓力下，ychJ敲除株的生存能力顯著降低，僅為野生型的10%-60%.在半固體平板實驗中，ychJ敲除株的擴散直徑達到（5.00±0.10）cm,顯著大于野生株的（1.933±0.1155）cm,表明ychJ敲除株表現出更強的移動能力。結論未知功能蛋白YchJ的缺失會影響鼠傷寒沙門菌的運動能力、生物膜形成能力和抗生素耐受能力，為沙門菌及其他胞內寄生菌YchJ功能的確定提供理論基礎。
鼠傷寒沙門菌是一種兼性胞內寄生的革蘭陰性菌，能通過污染的水和食物進入人體腸道，侵入小腸絨毛上皮細胞進入宿主體內，而后被巨噬細胞吞噬，隨巨噬細胞擴散到淋巴結、肝臟和脾臟，進而引發全身多器官感染和菌血癥。據估計，全球每年有超過9萬人死于與沙門菌感染引發的疾病，且其耐藥性也不斷增強，已被世界衛生組織認定為“15種嚴重耐藥的病原菌”之一。因此，沙門菌作為“對公共衛生最具威脅的細菌”之一，對其致病機制的深入備受關注。
在侵染宿主過程中，沙門菌面臨一系列生存壓力，包括營養匱乏、環境變化、宿主免疫系統的攻擊、以及抗生素的殺傷，宿主通過這些不利壓力環境來快速殺滅沙門菌。然而，在與宿主相互作用過程中，沙門菌通過一系列適應性防御機制來應對這些挑戰。鞭毛作為沙門菌的運動器官，不僅通過趨化性引導沙門菌找到最佳的感染部位，還幫助其逃避宿主免疫細胞的捕獲。生物膜可作為自我保護屏障幫助沙門菌抵御宿主各種環境壓力、免疫系統攻擊和抗生素殺傷，從而提高沙門菌的生存能力。此外，沙門菌還可以通過調節關鍵蛋白的表達水平來增強其對抗生素的耐受性。這些機制不僅增強了沙門菌在宿主體內的生存和繁殖能力，還可導致其耐藥性的產生，增加治療的難度。因此，探究沙門菌所面臨的生存壓力及其應對機制對開發新的抗菌藥物靶標和制定有效預防策略至關重要。
YchJ是細菌的未知功能蛋白之一，其相關研究鮮有報道。前期研究表明，YchJ影響大腸埃希菌生物膜的形成和蛋白質的分泌，提示YchJ可能在大腸埃希菌的抗逆能力中發揮重要作用。目前，沙門菌YchJ蛋白功能的相關及該基因缺失后對于菌株的影響尚不清楚。因此，本研究基于CRISPRCas9技術成功構建鼠傷寒沙門菌ychJ基因敲除株，比較野生株和敲除株的運動能力、生物膜形成能力和抗生素耐受能力，旨在為沙門菌及胞內寄生菌YchJ功能的確定提供理論基礎。
1、材料與方法
1.1菌株及質粒
鼠傷寒沙門菌ATCC14028s（WT菌株）菌株購于美國ATCC菌種庫，CRISPRB質粒購于廣州源井生物科技有限公司。
1.2主要試劑和儀器
引物序列由鉑尚公司合成；PCR基因擴增儀購自美國Thermo公司；氨芐青霉素（Amp）和諾氟沙星購自北京索萊寶科技有限公司；mRNA逆轉錄試劑盒購自南京諾維贊公司；mRNA提取試劑盒購自山東思科捷生物技術有限公司；實時熒光定量PCR試劑盒購自Takara寶日醫生物技術（北京）有限公司；全自動生長曲線分析儀以及生長曲線分析儀專用微孔板均購自丹麥Biosense公司。
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