鵪鶉肺炎克雷伯菌血清型鑒定、耐藥性檢測及致病潛力（一）
摘要：【目的】從腹瀉鵪鶉糞便樣本中分離并鑒定肺炎克雷伯菌，以期為鵪鶉肺炎克雷伯菌疾病防控提供基礎。【方法】從8份腹瀉鵪鶉糞便樣本中篩選純化菌落，通過平板劃線法對細菌進行分離純化培養，利用PCR擴增16SrDNA序列并測序，使用Mega11.0軟件構建系統進化樹。采用K-B法檢測菌株對常見抗菌藥物的敏感性，并檢測菌株中耐藥基因和毒力基因分布情況，探究其生物學特性，通過動物試驗評估菌株的致病性。【結果】本研究從腹瀉鵪鶉糞便樣本中分離并鑒定出2株肺炎克雷伯菌，分別命名為Ksp-A1和Ksp-A2,均屬于K57血清型。系統進化樹結果顯示，2株分離株與其他已知肺炎克雷伯菌株相似性較高，且與肺炎克雷伯菌DB-4和WGT-31株屬于同一進化分支。藥敏試驗結果顯示，分離株對氨芐西林、苯唑西林和紅霉素等表現耐藥。分離株Ksp-A1和Ksp-A2均攜帶多種耐藥基因，包括blaSHV、aacC2、oqxAB、tetA、tetM和cat1基因。2株分離株均攜帶毒力基因K88、hlyE、iucD、irp2、ompA和ompC.生物學特性分析顯示，在pH7.0的LB肉湯培養基中，分離株Ksp-A1和Ksp-A2均在2h內進入對數生長期，并分別在12和9h達到峰值。小鼠致病性試驗結果顯示，注射菌液后，小鼠表現被毛粗亂、精神沉郁、呼吸急促及腹瀉等感染癥狀，且隨著菌液濃度增加，小鼠死亡率逐漸上升，菌液濃度為1×109CFU/mL時，小鼠死亡率均達100%,Ksp-A1和Ksp-A2對小鼠的半數致死劑量（LD50）分別為3.3×107和2.6×106CFU.【結論】試驗成功分離獲得2株鵪鶉源K57型肺炎克雷伯菌，其對β-內酰胺類藥物表現耐藥，生長速度較快，對酸堿耐受能力強。研究結果為鵪鶉源肺炎克雷伯菌疾病的防治提供了基礎數據。
肺炎克雷伯菌（Klebsiellapneumoniae）屬于腸桿菌科（Enterobacteriaceae）克雷伯菌屬（Klebsiella），是一種革蘭陰性菌，常見于動物黏膜或自然環境中。肺炎克雷伯菌具有多種質粒和可移動遺傳原件，這些遺傳原件使其攜帶多種抗性基因或者從環境中獲取新的抗性基因，再將這些耐藥基因傳給敏感菌株，從而造成超級耐藥菌株的出現，導致疾病的發生。
2020年中國細菌耐藥監測報告指出，醫源肺炎克雷伯菌在醫源革蘭陰性菌中的分離率排第二，僅次于大腸桿菌，耐藥性呈明顯上升趨勢。肺炎克雷伯菌的毒力因子和血清型的研究對于理解其致病機制、制定有效的防控策略具有重要意義。其毒力因子包括莢膜（capsule）、菌毛（fimbriae）、外膜蛋白（outermembraneproteins）等，它們共同作用，增強了細菌對宿主的侵襲力和抵抗宿主免疫反應的能力。
血清型研究有助于識別不同肺炎克雷伯菌株的流行病學特征，為疫情監測和控制提供科學依據。鵪鶉作為一種常見的禽類，其飼養過程中的健康管理對于控制和預防耐藥菌的傳播具有重要意義。然而，目前關于肺炎克雷伯菌在鵪鶉中的流行情況、耐藥性和毒力基因的相關報道較少。有研究表明，不同宿主來源的肺炎克雷伯菌在耐藥性和分子特點上存在差異，這可能影響其在人與動物間的傳播。近年來，隨著養禽業的快速發展，鵪鶉等禽類的細菌感染率及耐藥性呈明顯上升趨勢，對禽類疾病防控構成了嚴峻挑戰。然而，目前關于鵪鶉源病原菌的耐藥性及毒力基因分布的研究較為匱乏。本研究擬從腹瀉鵪鶉糞便樣本中分離并鑒定病原菌，通過對分離菌株的基因型和血清型鑒定、耐藥性檢測、毒力基因篩查等生物學分析，評估其耐藥機制與致病潛力，以期為相關疾病防控、疫苗開發及抗菌藥合理使用提供參考。
1材料與方法
1.1樣品來源及試驗
動物8份12周齡鵪鶉腹瀉糞便樣品采集于新疆阿克蘇地區某養禽場；120只6周齡、25-30gCL級昆明小鼠（雌雄各半）購自塔里木大學動物科學與技術學院合作實驗動物中心。
本研究所有動物試驗嚴格遵循相關動物倫理法規，所有操作符合塔里木大學實驗動物中心動物福利要求。
1.2主要試劑及儀器
LB瓊脂培養基、LB肉湯培養基、麥康凱瓊脂培養基、SS瓊脂培養基、均購自杭州微生物試劑有限公司；革蘭染色試劑盒購自北京酷來搏科技有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；2×EasyTaqPCRSuperMix（+Dye）購自北京全式金生物技術股份有限公司。
梯度PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀均購自Bio-Rad公司；oCelloScope微生物快速藥敏監測系統購自丹麥BioSense公司；隔水式恒溫培養箱購自上海博迅實業有限公司醫療設備廠。
1.3病原菌的分離培養及生長特性鑒定
使用滅菌接種環分別將8份腹瀉鵪鶉糞便樣品劃線接種于LB瓊脂培養基，37℃恒溫培養箱倒置培養12h.挑取疑似菌落接種于LB肉湯培養基，再劃線接種于LB瓊脂培養基，將純培養單菌落分別劃線接種于麥康凱瓊脂、SS瓊脂和LB瓊脂平板，觀察細菌生長狀態，使用革蘭染色試劑盒對細菌進行染色，于顯微鏡下觀察菌體形態特征。純培養菌株使用50%甘油細胞凍存管于―80℃保種備用。
1.4分離菌株的生化鑒定
將分離的純培養菌株接種到LB肉湯培養基，37℃、180r/min過夜震蕩培養，對純培養細菌進行生化鑒定。將預培養的菌液接種到各生化鑒定試劑管中，每個測試項目接種5-10μL菌液，并設置無菌水作為空白對照。將接種后的生化鑒定試劑板放置于37℃恒溫培養箱中培養24h.觀察并記錄每個孔中的生化反應結果，將生化反應評估結果與肺炎克雷伯菌的標準生化特性進行對比，確定菌株的生化特征。
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