不同霉變時期肉豆蔻飲片需氧菌、霉菌、酵母菌菌落總數(shù)統(tǒng)計（二）
2.3.2霉菌、酵母菌培養(yǎng)基適用性試驗
分別移取黑曲霉、白色念珠菌菌液1 mL（含菌量50-100 cfu）至滅菌平皿中，分別傾倒沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂對照培養(yǎng)基15 mL，待其凝固后，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中20-25℃培養(yǎng)72 h。每個菌種每種類型培養(yǎng)基各做3個平行。測定菌落數(shù)。
被檢固體培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)與對照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)比值應(yīng)在0.5-2范圍內(nèi)，且菌落形態(tài)大小與應(yīng)與對照培養(yǎng)基上的菌落一致。結(jié)果（表2，圖3），被檢固體培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)與對照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)均在0.5-2范圍內(nèi)。被檢固體培養(yǎng)基上菌落形態(tài)大小與對照培養(yǎng)基上的菌落一致。
2.4計數(shù)方法適用性試驗
2.4.1需氧菌總數(shù)計數(shù)方法適用性試驗
試驗組：分別移取1∶1000、1∶10000、1∶100000供試液9.9 mL于滅菌試管中，加入制備好的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉及白色念珠菌菌液0.1 mL，使其終濃度為每1 mL供試液中含菌量不大于100 cfu。從試管中移取1 mL至滅菌平皿中，立刻傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，待其凝固后倒置于霉菌培養(yǎng)箱中30-35℃培養(yǎng)48 h。每個菌種平行制備2個平皿，測定試驗組菌落數(shù)。
圖3 a黑曲霉；b白色念珠菌
表3需氧菌總數(shù)計數(shù)方法適用性試驗結(jié)果
供試品對照組：分別移取1∶1000、1∶10000、1∶100000供試液9.9 mL于滅菌試管中，加入0.1 mL無菌生理鹽水，其余按試驗組操作。測定供試品對照組菌落數(shù)。
菌液對照組：取9.9 mL無菌生理鹽水于滅菌試管中，加入與試驗組相同的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉及白色念珠菌菌液0.1 mL，使其終濃度為每1 mL供試液中含菌量不大于100 cfu，其余按試驗組操作。測定菌液對照組菌落數(shù)，進行微生物回收試驗。
陰性對照組：移取1 mL無菌生理鹽水于滅菌平皿中，其余按試驗組操作。平行制備2個平皿。
按回收率=[（試驗組平均菌落數(shù)-供試品對照組平均菌落數(shù)）/菌液對照組平均菌落數(shù)]計算回收率，結(jié)果（表3）。根據(jù)2015年版《中國藥典》，采用平皿法時，回收率應(yīng)在0.5-2范圍內(nèi)。可得出，金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉需稀釋至1∶10000，白色念珠菌需稀釋至1∶100000方能達到回收率要求。
2.4.2霉菌、酵母菌總數(shù)計數(shù)方法適用性試驗
分別移取1∶10000、1∶100000、1∶1000000供試液9.9 mL于滅菌試管中，加入制備好的黑曲霉、白色念珠菌菌液0.1 mL，使其終濃度為每1 mL供試液中含菌量不大于100 cfu。從試管中移取1 mL至滅菌平皿中，立刻傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，待其凝固后倒置于霉菌培養(yǎng)箱中20-25℃培養(yǎng)72 h。每個菌種平行制備2個平皿，測定試驗組菌落數(shù)。
同法測定供試品對照組、菌液對照組和陰性對照組菌落數(shù)。
按回收率=[（試驗組平均菌落數(shù)-供試品對照組平均菌落數(shù)）/菌液對照組平均菌落數(shù)]計算回收率，結(jié)果（表4）。根據(jù)2015年版《中國藥典》，采用平皿法時，回收率應(yīng)在0.5-2范圍內(nèi)。可得出，黑曲霉需稀釋至1∶10000，白色念珠菌需稀釋至1∶1000000方能達到回收率要求。
表4霉菌、酵母菌總數(shù)計數(shù)方法適用性試驗結(jié)果
表5不同霉變程度肉豆蔻飲片菌落總數(shù)
2.5不同霉變程度樣品菌落總數(shù)測定
綜上，選用1∶1000、1∶10000、1∶100000、1∶1000000四個稀釋度的供試液來測定不同霉變程度肉豆蔻飲片中需氧菌、霉菌及酵母菌的菌落總數(shù)。結(jié)果（表5）。顯示，隨著加速時間的延長，肉豆蔻樣品中需氧菌菌落總數(shù)、霉菌、酵母菌菌落總數(shù)均呈上升趨勢，且增長迅速。
3討論
實驗結(jié)果表明金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌及黑曲霉采用1:10普通平皿法進行方法適用性驗證時，菌落數(shù)量較多，難以計數(shù)，不適合作為肉豆蔻飲片的微生物計數(shù)方法。經(jīng)試驗選用1∶1000、1∶10000、1∶100000、1∶1000000四個稀釋度來進行肉豆蔻飲片微生物計數(shù)的方法學(xué)驗證。其中金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌需稀釋至1∶10000回收率可達到要求，而銅綠假單胞菌需稀釋至1∶100000稀釋級，才能達到回收率要求。黑曲霉和白色念珠菌分別在1∶10000、1∶100000稀釋級時才能達到回收率要求。
通過對不同霉變程度肉豆蔻飲片微生物計數(shù)結(jié)果研究發(fā)現(xiàn)，隨著加速時間的延長，肉豆蔻飲片霉變現(xiàn)象逐漸嚴(yán)重，且需氧菌和霉菌、酵母菌菌落總數(shù)均呈上升趨勢，且加速0-6天時增長緩慢，6-9天呈爆發(fā)式增長，9-39天勻速增長。提示我們?nèi)舛罐⒆鳛槌Ｓ盟幨硟捎盟幉脑趦Σ剡^程中應(yīng)實時監(jiān)控其菌落總數(shù)，必要時增設(shè)微生物限度檢查以保證用藥的安全性與有效性。
有文獻報道，中藥飲片普遍受到多種微生物的污染，污染程度十分嚴(yán)重且污染的優(yōu)勢菌屬大都是已知的產(chǎn)毒霉菌，因此在后續(xù)研究中應(yīng)進一步研究肉豆蔻在霉變過程中產(chǎn)毒霉菌及控制菌的變化規(guī)律，及霉變產(chǎn)生的菌株對肉豆蔻飲片藥效成分含量的影響，為建立更完善的肉豆蔻飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。
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