水貂腸道乳酸桿菌RSJ生長曲線及產酸、藥敏試驗結果（一）
近年來，水貂等小型毛皮動物消化道菌群的研究已成為一個重要的新課題。但目前國內對動物消化道菌群的研究報道較少，尤其是對水貂腸道菌群的研究未見報道。其中，乳酸菌作為動物腸道中的優勢菌群之一，其對動物的有益作用已被許多研究結果所證實。乳酸桿菌是仔豬腸道正常微生物區系中的優勢菌群，可利用糖類發酵產生大量乳酸、乙酸及其他揮發性脂肪酸，對維持仔豬腸道微生物區系平衡和消化機能起著重要作用。市售乳酸桿菌菌株大部分是從人和哺乳動物腸道中或土壤中分離得到的。寄主的遺傳特性和環境影響腸道菌群結構和組成，寄主和腸道菌之間存在著相互選擇、相互依賴的關系，因而一種適于某類動物的微生態制劑不一定適于另一類動物。要保持定植能力，活菌制劑的生產菌種應從同種屬宿主分離。鑒于此,本研究擬從健康水貂腸道中分離篩選出耐酸、抑菌效果好、安全等特點的菌株，為開發應用于防治水貂腹瀉性疾病的微生態制劑提供參考依據。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1試驗材料
健康成年丹麥紅眼母貂1只，來自青島某水貂養殖場。
1.1.2主要試劑
營養瓊脂培養基、營養肉湯培養基購自北京奧博星生物技術公司，莫匹羅星鋰鹽改良MRS培養基購于青島高科園海博生物技術有限公司、糖醇發酵管(葡、麥、蔗、乳、甘、木、果、山、七葉苷等)、藥敏紙片購杭州天和微生物試劑有限公司。
1.1.3 DNA提取和16S rRNA基因擴增所用試劑
PBS緩沖液，TE緩沖液，細菌裂解液，Premixed Taq(incl dye)、DL 2 000 DNA Marker購自北京托普賽生物有限公司，電泳級瓊脂糖Agarose Regular購自TaKaRa公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。
1.2方法
1.2.1樣品的采集與處理
分別取各段腸粘膜和糞便樣品1 g，分別置于含生理鹽水9 mL三角瓶，振蕩混勻30 min，制成勻漿后，靜置15 min，制成10-1的稀釋液。
1.2.2分離純化
取樣品的稀釋液100μL涂布于含有碳酸鈣的MRS培養基上，厭氧37℃培養24 h。挑取有溶鈣圈的菌落，進行革蘭氏染色鏡檢。疑似陽性的菌落接種到莫匹羅星鋰鹽改良MRS培養基中純化培養。
1.2.3生化試驗
鑒定按常規方法對分離的菌株進行過氧化氫酶試驗，氧化酶試驗、KOH試驗，吲哚試驗、硫化氫試驗、糖醇發酵試驗、MR試驗、VP試驗、尿素酶試驗、西蒙氏枸櫞酸鹽試驗、明膠液化試驗及運動力試驗等。
1.2.4 16S rRNA基因片段的序列分析將分離的菌株接種于5 mL營養肉湯中培養，取4.5 mL菌液12 000 r/min離心2 min，參考文獻的方法提取DNA。
參考相關文獻，由上海生工生物工程有限公司合成了一對為乳酸桿菌屬特異性引物(Lac16S正向371 5'-GCAGTAGGGAATCTTCCACA-3'，Lac16S反向593 5'-GCTTTA CGCCCAATAAATC-3'，擴增片斷長度為223 bp)。
PCR反應體系：Premixed Taq 25μL，正反向引物各加1μL，DNA模板2μL，補ddH2O至體積為50μL。PCR擴增程序為：94℃5 min預變性；94℃30 s變性，56℃30 s退火，72℃30 s延伸，循環35次；72℃5 min延伸。取5μL PCR產物于1.0%瓊脂糖凝膠(含0.5μg/mL EB)電泳后在凝膠成像儀中觀察擴增結果。
PCR產物經試劑盒純化后，送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。采用BLAST與GenBank數據庫中已收錄的乳酸桿菌屬16S rRNA的序列比對，并使用MegAlian中的Clustal X Method進行同源性比較。
1.2.5耐酸試驗
調節營養肉湯pH為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，分別裝入試管中，每管5 mL。將菌株液體培養物10μL接入，37℃培養24 h，觀察菌株生長情況。
1.2.6生長曲線及產酸試驗
將篩選出的乳酸菌接種于盛有MRS液體培養基(接種量為1∶50)的三角瓶中，37℃，200 r/min培養48 h。其中每隔2 h取樣于紫外分光光度計測定菌液的OD值(600 nm)和pH，并繪制曲線。用未接種的培養基作空白對照。
1.2.7藥敏試驗
采用紙片擴散試驗法。將乳酸菌懸液稀釋至108 cfu/mL后取100 uL涂布于MRS培養基上，用滅菌的鑷子將藥敏片貼到培養基表面，輕輕壓實。將培養基置于37℃培養24 h，測定藥敏圈直徑。
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