枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定、來源OMVs的分離純
枯草芽孢桿菌是芽孢桿菌屬的一種最常見的菌種，廣泛分布在土壤及腐敗的有機(jī)物中，并且該菌種是植物體內(nèi)常見的內(nèi)生細(xì)菌，加上枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)快，營(yíng)養(yǎng)比較簡(jiǎn)單，能產(chǎn)生耐熱、抗逆的芽孢，所以不少菌肥(劑)中都添加了它。當(dāng)然，這個(gè)枯草芽孢桿菌被廣泛運(yùn)用還因?yàn)樗谠鰪?qiáng)作物抗性、促進(jìn)作物生長(zhǎng)、改良土壤、提高作物品質(zhì)等方面的強(qiáng)大作用。可以說，用得好，它既是藥，又是肥，還是植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。那么枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線如何繪制？下面提供詳細(xì)步驟。
枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定：
將-80℃保存的枯草芽孢桿菌甘油凍存液，按1︰100的比例接種到5mLLB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm/min條件下培養(yǎng)至菌液OD600值為0.6左右。配制兩瓶100mL無菌的LB培養(yǎng)基，按1︰100的比例將OD600值為0.6左右的種子菌液無菌接種到100mLLB培養(yǎng)基中，其中一瓶不接種，作為陰性對(duì)照組。于37℃、200rpm/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)的0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24h取出1mL菌液，在96孔板中每孔加入200μL菌液，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，在酶標(biāo)儀中檢測(cè)OD600值，制作枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)曲線。選取枯草芽孢桿菌處在穩(wěn)定生長(zhǎng)期的初期階段，進(jìn)行枯草芽孢桿菌來源OMVs的分離純化。
枯草芽孢桿菌來源OMVs的分離純化：
按1︰100的比例，將100μL枯草芽孢桿菌甘油凍存液無菌接種到10mLLB培養(yǎng)基中，于37℃、200rpm/min條件下培養(yǎng)至菌液OD600值為0.6左右。將上述250μL枯草芽孢桿菌種子液無菌接種到含250mLLB培養(yǎng)基的1L培養(yǎng)瓶中(兩瓶)，于37℃、200rpm/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)至穩(wěn)定生長(zhǎng)期的初期階段。收集處于穩(wěn)定生長(zhǎng)期初期階段的枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液500mL，在4℃，15000g條件下離心20min去除細(xì)菌后取上清液，過0.45μm濾膜去除雜質(zhì)后收集上清液，上清液過0.22μm濾膜后收集上清，將上清經(jīng)100kD濾膜進(jìn)行超濾處理，去除蛋白質(zhì)等大分子雜質(zhì)，用200μL無菌PBS溶液溶解沉淀物，得到枯草芽孢桿菌來源OMVs的濃縮液。
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