大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞MSCs生長曲線測定及細(xì)胞形態(tài)觀察
探討曲古抑菌素(trichostatin A，TSA)對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(marrow mesenchymal stem cells，MSCs)特化為成骨細(xì)胞的影響。方法采用全骨髓貼壁法體外分離、培養(yǎng)、純化大鼠MSCs，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察；選擇第3代MSCs定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞，根據(jù)給藥濃度不同分為TSA低劑量組(0.1μmol/L)、中劑量組(1μmol/L)、高劑量組(10μmol/L)，同時設(shè)立空白對照組。MTT法觀察各組對MSCs的增殖作用并繪制細(xì)胞生長曲線，檢測TSA對MSCs誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞過程中堿性磷酸酶(alkaliphosphatase，ALP)活性的影響；RT-PCR法檢測TSA對核心結(jié)合因子α-1(corebinding factorα1，Cbfα1)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factors-1，IGF-1)mRNA表達(dá)水平的影響。
結(jié)果MSCs生長曲線的測定結(jié)果顯示，各組細(xì)胞生長曲線趨勢相似，與對照組相比，TSA低劑量組的生長曲線沒有顯著性變化，TSA中劑量及高劑量均顯著促進(jìn)MSCs增殖(P<0.05)。與對照組相比，TSA低劑量組、中劑量組、高劑量組對MSCs誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞過程中的第4、5、6 E均可顯著提高ALP活性(P<0.05)。與空白組相比，TSA各劑量組可以顯著提高Cbfα1、bFGF、IGF-1mRNA表達(dá)水平(P<0.05)。
MSCs生長曲線的測定：將生長狀態(tài)良好的第2代MSCs以密度為5×103個接種于96孔培養(yǎng)板中，置于37℃、CO2飽和濕度的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按上述TSA劑量分別加入各組中每天取1板進(jìn)行MTT檢測，連續(xù)1周。MTT檢測時應(yīng)用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測各孔吸光度值，選擇波長為492 nm。按照檢測結(jié)果，以光吸收值為縱坐標(biāo)，以細(xì)胞生長天數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線。
MSCs細(xì)胞形態(tài)觀察
倒置相差顯微鏡下可見MSCs為圓形，大小不一，培養(yǎng)24 h后，開始貼壁，呈圓形，梭形，或多角形；5 d后，可見放射狀排列的細(xì)胞群，多為梭形，胞漿豐富，胞核大，核仁清晰。見圖1。
圖1 MSCs細(xì)胞形態(tài)觀察圖(×1000)Fig.1 MSCs cell morphological observation(×1000)
MSCs生長曲線的測定
各組細(xì)胞生長曲線趨勢相似，在MSCs接種給藥第1、2天為細(xì)胞潛伏適應(yīng)期，而3～6 d曲線呈直線上升，則為MSCs的對數(shù)生長期。第7天后曲線上升趨勢逐漸變得平緩，MSCs增殖速度明顯減慢，進(jìn)入平臺期。與對照組相比，TSA低劑量組的生長曲線沒有顯著性變化，TSA中劑量及高劑量均有顯著升高M(jìn)SCs生長曲線的趨勢，有效增強(qiáng)了MSCs的擴(kuò)增能力(P<0.05)。見圖2。
圖2不同組的MSCs生長曲線*P<0.05，與空白對照組比較
結(jié)論TSA可顯著促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞特化為成骨細(xì)胞，可能是通過上調(diào)Cbfα1、bFGF、IGF-1基因的表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)。
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