國(guó)內(nèi)新發(fā)病原牛皰疹病毒4型(BoHV-4)qPCR鑒定、分離及一步生長(zhǎng)曲線測(cè)定（二）
1.3病料處理及qPCR鑒定
使用合適長(zhǎng)度的拭子采集30份患有生殖道皰疹或繁殖障礙的荷斯坦奶牛生殖道拭子，將拭子樣品凍融2～3次，樣品液經(jīng)10 000 r·min-1離心10 min，取上清液，采用RT-PCR和qPCR檢測(cè)BoHV-4、BoHV-1和BVDV。qPCR及RT-qPCR體系各組分如下:反應(yīng)酶12.5μL，上、下游引物各0.4μL，探針0.2μL，ddH2O 6.5μL，模板0.4μL。加完樣后蓋緊管蓋，混勻，低速瞬時(shí)離心，使反應(yīng)液集中管底后放入qPCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。
BoHV-1的qPCR反應(yīng)程序:37℃孵育2 min;95℃預(yù)變性20 s，95℃變性10 s，60℃退火延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。BVDV的RT-qPCR反應(yīng)程序:50℃反轉(zhuǎn)錄15 min，95℃預(yù)變性30 s，95℃變性10 s，60℃退火延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。
1.4病毒分離
取1.3節(jié)中鑒定為BoHV-4陽(yáng)性的病料1 mL，經(jīng)過(guò)0.22μm孔徑濾器過(guò)濾，濾液作為接種材料。接種前，棄去6孔細(xì)胞板中的培養(yǎng)液，加入PBS后潤(rùn)洗細(xì)胞3次。接種后37℃吸附2 h，每隔30 min輕輕搖晃鋪有HeLa細(xì)胞的細(xì)胞板。吸附結(jié)束后補(bǔ)加細(xì)胞維持液。對(duì)照孔不接種。置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天觀察是否出現(xiàn)細(xì)胞病變。盲傳3代后取400μL細(xì)胞培養(yǎng)物，通過(guò)磁珠法提取試劑盒提取核酸，用qPCR鑒定BoHV-4、BoHV-1和BVDV。
1.5病毒感染細(xì)胞的間接免疫熒光鑒定
將gB基因片段連接至pET-32a(+)載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a-gB，測(cè)序正確后轉(zhuǎn)化BL21工程菌原核表達(dá)BoHV-4的gB蛋白，純化后免疫Balb/c小鼠制備多克隆抗體，3次免疫后效價(jià)達(dá)到1:409 600。取1.4節(jié)中的病毒液，接種于鋪有HeLa細(xì)胞的6孔板中，每孔接種100μL，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。棄去上清液，每孔加入4%多聚甲醛固定液100μL，4℃固定10 min。將固定液吸出，PBS清洗3次后加入通透液0.5%Triton-100 100μL，室溫通透5 min。PBS清洗3次后加入100μL 50 g·L-1 BSA溶液，室溫封閉1 h。棄BSA，PBS沖洗3次后加入100μL 1:200稀釋的BoHV-4 gB蛋白小鼠多克隆抗體，37℃孵育1～2 h。PBS沖洗后加入FITC標(biāo)記羊抗小鼠熒光二抗，37℃孵育40 min，PBS清洗后于熒光顯微鏡下觀察。
1.6病毒的透射電鏡觀察
感染后的細(xì)胞待出現(xiàn)細(xì)胞病變后棄培養(yǎng)液，加入電鏡固定液，常溫避光固定約5 min，用細(xì)胞刮沿同一方向輕輕刮下細(xì)胞，用巴氏吸管吸入離心管內(nèi)，放入離心機(jī)，低速(≤3 000 r·min-1)離心3～5 min，得到綠豆大小細(xì)胞團(tuán)。棄固定液后加入新的電鏡固定液，吹散細(xì)胞團(tuán)并重懸，4℃過(guò)夜固定，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新利用全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制樣，再通過(guò)電子顯微鏡(HITACHI HT7700)觀察并拍照。
1.7病毒的一步生長(zhǎng)曲線測(cè)定
為明確病毒在細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)情況，將HeLa細(xì)胞提前傳代后接種12孔板，待鋪成單層細(xì)胞，以MOI為0.1的病毒量感染HeLa細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照。37℃孵育2 h后棄病毒液，用PBS清洗2～3次后加入含2%FBS的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。分別于接毒后6、12、24、36、48和72 h收取細(xì)胞培養(yǎng)物，丹麥Biosense微生物生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)通過(guò)測(cè)定每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的TCID50來(lái)計(jì)算病毒滴度，繪制生長(zhǎng)曲線。
1.8 BoHV-4的gB和TK基因序列擴(kuò)增
以病毒DNA為模板，分別以gB-F/R和TK-F/R為引物，對(duì)病毒的gB和TK基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系如下:2×Phanta Master Mix 25μL，上、下游引物各2μL，模板5μL，ddH2O補(bǔ)至50μL。PCR反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，膠回收PCR陽(yáng)性產(chǎn)物后送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。
1.9 BoHV-4病毒gB和TK序列遺傳進(jìn)化分析
將gB和TK基因的序列用NCBI中的BLAST工具進(jìn)行在線比對(duì)，使用MEGA 11軟件，參照BoHV-4參考毒株DN599(GenBank登錄號(hào):JQ838062.1)、Movar 33/63(AB035516)以及NCBI上的其他分離株序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，繪制分離株gB和TK基因的遺傳進(jìn)化樹(shù)，并分析其進(jìn)化規(guī)律。
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