忍冬提取液對酸土脂環酸芽孢桿菌生長曲線、細胞形態和生物膜形成能力的影響（二）
1.2實驗方法
1.2.1忍冬不同部位總酚、總黃酮和綠原酸含量測定
1.2.1.1忍冬不同部位總酚、總黃酮和綠原酸的提取
將金銀花、忍冬葉和忍冬藤60℃熱風干燥至恒重，粉碎后過50目篩，備用。稱取1 g樣品，加入15 mL 60%乙醇，60℃、200 W超聲水浴提取30 min。在4℃下10000 r/min離心10 min，收集上清液，過0.22μm濾膜，于4℃冰箱保存。
1.2.1.2總酚含量的測定
采用Folin-Ciocalteu法，將1 mL樣品與5 mL Folin-Ciocalteu混合，反應5 min，加入4 mL 7.5%Na2CO3溶液，避光反應60 min，在765 nm下測定。根據沒食子酸標準曲線的線性回歸方程（y=0.0067x?0.0781，R2=0.9979）計算總酚含量，結果以每g樣品的沒食子酸當量mg表示（mg GAE/g）。
1.2.1.3總黃酮含量的測定
采用AlCl3比色法，將1 mL樣品與0.5 mL 5%NaNO2溶液混合，反應5 min，加入1 mL 5%AlCl3溶液反應5 min，加入2 mL 8%NaOH溶液反應10 min，在510 nm下測定。根據蘆丁標準曲線的線性回歸方程（y=0.0026x?0.0399，R2=0.9991）計算總黃酮含量，結果以每g樣品的蘆丁當量mg表示（mg RE/g）。
1.2.1.4綠原酸含量的測定
采用高效液相色譜法，色譜柱：Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；色譜條件：溫度30℃；檢測波長320 nm；進樣體積20μL；體積流量0.6 mL/min；流動相為甲醇（A）-0.1%甲酸水（B）；梯度洗脫條件為0~10 min，5%~30%A；10~25 min，30%~50%A；25~35 min，50%~70%A；35~40 min，70%~5%A。以綠原酸濃度（mg/mL）為橫坐標（x），色譜峰面積為縱坐標（y），繪制標準曲線。根據綠原酸標準曲線的線性回歸方程（y=30726x?688902，R2=0.9996）計算綠原酸含量，結果以每g樣品的綠原酸當量mg表示（mg CGA/g）。
1.2.2忍冬不同部位提取液抑菌譜的測定
1.2.2.1菌株的活化與培養
菌株培養基的選擇與制備：L.acidophilus、L.plantarum、L.rhamnosus選用MRS肉湯培養基；A.acidoterrestris選用AAM培養基；S.agalactiae、L.monocytogenes選用BHI培養基；S.aureus、B.subtilis選用牛肉膏蛋白胨培養基；E.coli、Salmonella選用LB培養基；C.jejuni選用布氏肉湯培養基；K.marxianus選用YPD培養基。固體培養基均在液體培養基的基礎上加入2%的瓊脂粉，在121℃下高壓滅菌15 min。菌株的活化：將凍藏菌株分別接種于相應液體培養基中，然后在37℃、250 r/min條件下振蕩培養24 h（A.acidoterrestris培養溫度為45℃），然后將菌液稀釋涂布，靜置培養18 h。菌株的培養：從各菌株平板上挑取一個單菌落，接種至10 mL培養基，過夜培養，然后以1.0%體積比轉接至50 mL培養基中培養至對數期，最后稀釋成1×106 CFU/mL的菌懸液，備用。
1.2.2.2忍冬不同部位提取液的制備
稱取10 g樣品，加入100 mL 60%乙醇，60℃、200 W超聲水浴提取30 min，10000 r/min離心10 min，收集上清液，向沉淀中再次加入100 mL乙醇，超聲水浴30 min后離心，重復3次。合并上清液，旋轉蒸發濃縮至10 mL，即得濃度為1 g/mL的提取液。
1.2.2.3抑菌譜的測定
采用牛津杯法，將100μL菌懸液均勻涂布于固體培養基平板上，用牛津杯在平板上打孔，然后加入提取液100μL，于恒溫箱中培養至肉眼觀察到透明圈為止，無菌水作空白對照，用十字交叉法測定抑菌圈直徑。
1.2.3忍冬不同部位提取液MIC和MBC的測定
采用二倍稀釋法，用液體培養基對提取液進行二倍稀釋，得到濃度為1000、500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95 mg/mL的忍冬提取液。分別將100μL各濃度忍冬提取液加入100μL菌懸液，混勻后培養24 h，以澄清無渾濁的最低濃度為最小抑菌濃度（MIC）。培養基作對照，用于驗證細菌正常生長，記為CK1；加入提取液而不加菌液，用于驗證提取液是否受污染，記為CK2。在MIC的基礎上，取培養液100μL均勻涂布于固體平板上培養48 h，以無活菌存在的最低濃度為最小殺菌濃度（MBC）。
1.2.4忍冬不同部位提取液對酸土脂環酸芽孢桿菌生長曲線的影響
參考Cui等的方法，向菌懸液中加入金銀花和忍冬葉提取液，至終濃度為1 MIC、2 MIC和MBC，不加提取液的作為對照組，45℃、250 r/min恒溫振蕩培養，每隔2 h取樣測定OD600 nm值，繪制生長曲線。
1.2.5忍冬不同部位提取液對酸土脂環酸芽孢桿菌細胞形態的影響
采用掃描電子顯微鏡（SEM）法，向菌懸液加入金銀花和忍冬葉提取液，至終濃度為1 MIC、2 MIC和4 MIC，不加提取液的作為對照組，45℃、250 r/min培養8 h。4000 r/min，離心10 min，棄上清液，用無菌PBS清洗2次，用1 mL 2.5%戊二醇固定細胞形態。用PBS（0.1 mol/L，pH7.0）洗滌3次，然后使用一系列梯度濃度的乙醇（30%、50%、80%、90%和95%）進行脫水，每種濃度進行2次，每次15 min。脫水后在?20℃下預凍2 h，然后真空冷凍干燥。干燥完全后濺射鍍金，在掃描電鏡下觀察。
1.2.6忍冬不同部位提取液對酸土脂環酸芽孢桿菌生物膜形成能力的影響
采用結晶紫染色法，將200μL菌懸液置于96孔板中，加入金銀花和忍冬葉提取液，至終濃度為1 MIC、2 MIC、4 MIC，不加提取液的作為對照組，45℃靜置培養24 h。吸出培養液，用200μL無菌PBS（0.03 mol/L，pH7.2）洗滌3次，加入100μL甲醇，固定15 min后吸出。加入100μL 1%結晶紫溶液，染色15 min，將結晶紫溶液吸出，用PBS將顏色沖洗干凈。加入100μL 33%CH3COOH溶液，用酶標儀測定OD590 nm值。
1.3數據處理
每組均進行3次平行實驗，結果均以平均值±標準差表示。采用SPSS 23.0進行數據分析，Origin 9.0進行繪圖。
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