碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌聯合藥敏試驗方法學、流程、優缺點和結果判讀（一）
1前言
碳青霉烯類抗菌藥物包括亞胺培南、美羅培南和厄他培南等，是治療多重耐藥革蘭陰性菌所致感染最有效的抗菌藥物之一。隨著該類藥物在臨床的廣泛使用，碳青霉烯類耐藥細菌（carbapenemresistant organisms，CRO）的檢出率呈逐年上升趨勢，其中以肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌為代表。CHINET中國細菌耐藥監測網2021年監測結果顯示，我國臨床分離肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌對亞胺培南的耐藥率分別為23.1%、23%和71.5%[1-2]。由于CRO通常還攜帶對其他抗菌藥物耐藥的基因，呈廣泛耐藥甚至全耐藥的特征，使臨床的抗感染治療面臨無藥可用的困境，導致感染患者的高病死率。CRO感染治療面臨的困境急需實驗室開展聯合藥敏試驗[3-11]，多藥聯合治療可延長抗菌藥物的使用壽命[12]，體外聯合藥敏試驗證實兩藥呈協同或相加作用的聯合，能有效改善CRO感染患者的病死率。聯合藥敏試驗可通過兩藥/多藥組合分析不同藥物之間的協同抗菌活性，在篩選針對CRO菌株所致感染的精準抗感染治療方案中發揮重要作用。為規范碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌聯合藥敏試驗及報告，上海市微生物學會微生物耐藥防控專委會、CHINET中國細菌耐藥監測網和上海市細菌真菌耐藥監測網組織專家對上述問題進行了討論，撰寫了專家共識并對聯合藥敏試驗方法和結果報告進行了推薦，以期對各醫療機構開展針對CRO菌株的聯合藥敏試驗及報告提供幫助。
2 CRO的定義及耐藥機制
碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細菌（carbapenemresistantEnterobacterales）定義為滿足以下任意一個條件[13]：①對亞胺培南、美羅培南、厄他培南或多利培南任何一種碳青霉烯類抗菌藥物耐藥者。對于天然對亞胺培南敏感性降低的細菌（如摩根菌屬、變形桿菌屬和普羅威登菌屬等），需參考除亞胺培南外的其他碳青霉烯類抗菌藥物的藥敏結果；②產生碳青霉烯酶。碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌（carbapenem-resistantPseudomonas aeruginosa，CRPA）和碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌（carbapenem-resistantAcinetobacter baumannii，CRAB）定義為對亞胺培南、美羅培南或多利培南任何一種碳青霉烯類抗菌藥物耐藥者。產生碳青霉烯酶是腸桿菌目細菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥最主要的機制，包括A類絲氨酸碳青霉烯酶（以KPC酶為主）、B類金屬β內酰胺酶（以NDM型金屬酶為主）和D類絲氨酸碳青霉烯酶（以OXA-48型酶為主）。銅綠假單胞菌對碳青霉烯類耐藥的主要機制包括AmpC酶高表達合并外膜滲透屏障、外排泵高表達以及產生碳青霉烯酶（包括KPC型碳青霉烯酶和金屬β內酰胺酶）等。鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類耐藥的主要機制是天然產生OXA-23、OXA-24或OXA-51型酶。
3開展聯合藥敏試驗的時機
僅當藥敏試驗結果顯示細菌對常規所有測試的抗菌藥物均耐藥，或臨床醫師有特殊治療需求時，開展聯合藥敏試驗篩選可能的多藥聯合治療方案。開展聯合藥敏試驗的時機參考圖1。
圖1聯合藥敏試驗時機及結果報告流程
4聯合藥敏的方法及其局限性
當前臨床微生物實驗室常規采用的藥敏試驗方法包括肉湯微量稀釋法、肉湯宏量稀釋法、瓊脂稀釋法、E試驗法、自動化藥敏儀器和紙片擴散法。除紙片擴散法為定性檢測方法外，其余均為定量檢測方法。聯合藥敏試驗方法包括肉湯微量稀釋棋盤法、瓊脂稀釋棋盤法、紙條法（包括E試驗條和MTS條）、紙片擴散法和聯合殺菌曲線等[16-21]。肉湯微量稀釋棋盤法和瓊脂稀釋棋盤法是聯合藥敏試驗的標準參考方法，但該方法操作繁瑣且基本為手工操作，導致常規實驗室開展的可操作性差。因此，操作簡單靈活的紙條法和紙片法不失為常規實驗室聯合藥敏可選擇的方法。
專家共識一：聯合藥敏試驗是臨床微生物室常規藥敏試驗的補充，僅對多重耐藥菌如碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌或臨床醫師有特殊治療需求的耐藥菌株進行聯合藥敏試驗，其他菌株不建議常規開展聯合藥敏試驗。
專家共識二：聯合藥敏試驗方法首選肉湯微量稀釋棋盤法，若實驗室無法開展肉湯微量稀釋棋盤法，可以紙條法或紙片擴散法替代。但需注意的是，紙條法或紙片擴散法結果僅供參考，如需確認應采用肉湯微量稀釋棋盤法。
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