基于刃天青微量板法檢測(cè)沙門氏菌抗生素的耐藥性（一）
摘要采用刃天青微量板法檢測(cè)多株沙門氏菌對(duì)抗生素的耐藥性，得到最小抑菌濃度（MIC）。通過(guò)肉眼觀察和熒光檢測(cè)都可判定沙門氏菌的耐藥性，判定時(shí)間僅需5 h，刃天青法與微量肉湯稀釋法檢測(cè)得到的耐藥性結(jié)果一致。其中用顏色觀察能更清晰明確地分辨出耐藥折點(diǎn)，熒光檢測(cè)可以動(dòng)態(tài)地反映細(xì)菌隨時(shí)間變化的生長(zhǎng)情況。刃天青微量板法具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高的特點(diǎn)，能確定抗生素的耐藥性和精確耐藥MIC值。
沙門氏菌（Salmonella）作為一種食源性病原體，對(duì)人類健康構(gòu)成了巨大威脅。沙門氏菌可通過(guò)受污染的畜禽產(chǎn)品、蛋、奶乃至海洋產(chǎn)品感染人類。近年來(lái)，由于抗生素的廣泛使用，出現(xiàn)了沙門氏菌耐藥株和多重耐藥株，導(dǎo)致沙門氏菌耐藥性問(wèn)題日益嚴(yán)重，對(duì)畜牧業(yè)和人類健康都構(gòu)成了潛在威脅。
為了應(yīng)對(duì)這種威脅，迫切需要進(jìn)行抗生素敏感測(cè)試（AST），以快速診斷這些危險(xiǎn)細(xì)菌的耐藥性，確保快速、準(zhǔn)確地使用抗生素。當(dāng)前，各種傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室方法可用來(lái)表征微生物對(duì)抗生素的體外敏感性，如常量肉湯稀釋和微量肉湯稀釋法、圓盤(pán)擴(kuò)散法和抗菌梯度法等。但是，這些方法多數(shù)都需要冗長(zhǎng)的測(cè)試程序，通常需要經(jīng)歷收集樣品、富集培養(yǎng)物，在這之后還至少需要孵育16 h才能進(jìn)行檢測(cè)。耐藥細(xì)菌的流行率增加表明現(xiàn)在迫切需要能夠在數(shù)小時(shí)而不是數(shù)天之內(nèi)提供藥敏性數(shù)據(jù)的AST。除了常規(guī)檢測(cè)方法，mPCR法和全自動(dòng)微生物分析儀測(cè)定法等新型檢測(cè)技術(shù)也已運(yùn)用在耐藥性檢測(cè)中。基于已知和賦予細(xì)菌抗性基因的擴(kuò)增和檢測(cè)技術(shù)，與常規(guī)培養(yǎng)方法相比，酶促擴(kuò)增技術(shù)減少了檢測(cè)時(shí)間。但這些技術(shù)需要大型且昂貴的儀器，這限制了它們?cè)谫Y源受限的環(huán)境中的使用。
刃天青（resazurin）作為一種氧化還原染料，活細(xì)菌可以將刃天青轉(zhuǎn)化為粉紅色的熒光染料試鹵靈（resorufin），繼續(xù)反應(yīng)可以變?yōu)榘咨珶o(wú)熒光的二氫試鹵靈（dihydroresorufin）。因其安全無(wú)毒、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的優(yōu)點(diǎn)，已被越來(lái)越多地應(yīng)用于細(xì)胞活力和細(xì)胞增殖能力的評(píng)估。以刃天青為指示劑的低成本藥敏試驗(yàn)方法，能動(dòng)態(tài)地反映細(xì)菌的生長(zhǎng)情況，可以檢測(cè)藥物的作用時(shí)間和細(xì)菌的耐藥情況。該研究采用刃天青法檢測(cè)沙門氏菌對(duì)幾種抗生素的敏感性，確定最佳試驗(yàn)條件，為沙門氏菌的快速、簡(jiǎn)便檢測(cè)提供一種新方法。
1材料與方法
1.1試材
氧氟沙星（Ofloxacin）、環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin）購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司;氯金酸（AuCl3·HCl·4H2O）購(gòu)自美國(guó)Sigma試劑有限公司;氨芐西林（Ampicillin）、美羅培南（Meropenem）、四環(huán)素（Tetracycline）、刃天青（Resazurin）、鹽酸（HCl）購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán);營(yíng)養(yǎng)肉湯（NB）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）購(gòu)自上海博威生物醫(yī)藥有限公司。所有溶液均用超純水制備，所有試劑均為分析純。鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028（Salmonella typhimurium）為實(shí)驗(yàn)室保存菌株，其余沙門氏菌（Salmonella）分離株均來(lái)自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，-80℃保存?zhèn)溆谩?
1.2儀器
Lab Dancer漩渦儀，IKA公司;Spectra MAX M5酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices;WGZ-XT細(xì)菌濁度儀，杭州齊威儀器有限公司;平底96孔細(xì)菌培養(yǎng)板， 丹麥Biosense公司;VB-40立式高溫高壓滅菌鍋，德國(guó)SYSTEC;BSC-1300超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;SHP-150生化培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;EX-OHOUS電子天平，美國(guó)奧豪斯公司;Milli-Q超純水儀，美國(guó)Millipore公司。
1.3細(xì)菌培養(yǎng)
取沙門氏菌接種于NB培養(yǎng)基，在37℃搖床培養(yǎng)，通過(guò)細(xì)菌濁度儀檢測(cè)細(xì)菌濃度。將濃度為0.5 MCF的菌液進(jìn)行梯度稀釋，取100μL涂布NA瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算出0.5 MCF菌液對(duì)應(yīng)的細(xì)菌培養(yǎng)物的菌落數(shù)及菌落形成單位（CFU/mL）。最后用NB將菌液稀釋成所需濃度，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?
1.4微量肉湯稀釋法藥敏試驗(yàn)
按美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）方案，將倍比稀釋的不同濃度的抗生素分別加到無(wú)菌的96孔培養(yǎng)板中，1～11孔加入系列稀釋抗生素100μL，第12孔不加抗生素作為陽(yáng)性生長(zhǎng)對(duì)照。將培養(yǎng)的沙門氏菌菌懸液稀釋至7.5×106 CFU/mL，向每孔中加100μL，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育。此時(shí)，1～11孔藥物濃度分別為128.000、64.000、32.000、16.000、8.000、4.000、2.000、1.000、0.500、0.250、0.125μg/mL。20 h后，觀察96孔培養(yǎng)板中的液體渾濁情況，判斷沙門氏菌是否生長(zhǎng)及其對(duì)所試抗生素的敏感性。
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