雙歧桿菌分離鑒定、耐受性試驗、益生特性試驗及安全性評價（三）
2.2雙歧桿菌菌株耐受特性篩選
2.2.1雙歧桿菌耐受酸和耐膽鹽能力測定
結果如圖3所示。以菌體密度增長量高于或與對照菌株相比差異不顯著作為篩選標準（V9在pH 3.0環境下厭氧培養12 h后菌體密度增長量為0.076，P＞0.05），結果見圖3A，共篩選得到23株雙歧桿菌進行后續試驗，其中假小鏈雙歧桿菌、齒雙歧桿菌不在可食用菌株名單中，因而最終選擇17株菌進行后續試驗。對17株pH 3.0酸性環境耐受能力較強的菌株進行耐受0.3%膽鹽濃度試驗，結果如圖3B所示，我們發現菌株MM28-5、FYF11-36、FYF23-17、SM035-3、FYF41-14培養12 h后菌體密度增長較高，因此選定該5株菌株進行模擬人工胃腸液耐受能力測定試驗。
圖3雙歧桿菌在pH 3.0、膽鹽0.3%環境中耐受情況
2.2.2模擬人工胃腸液耐受性試驗
結果如表2所示，對上述5株雙歧桿菌進行模擬人工胃腸液試驗，結果表明，模擬胃液環境培養3 h后5株雙歧桿菌活菌數均呈現下降趨勢，其中菌株FYF23-17胃液3 h存活率最高，為61.14%，菌株FYF41-14次之，為50.92%，菌株FYF11-36最少，僅有16.98%。經模擬腸液環境培養8 h后，菌株FYF41-14腸液8 h存活率為23.14%，菌株MM28-5次之，為18.07%，菌株FYF11-36和SM035-3存活率未達到10.00%，因此選取存活率較高的菌株FYF23-17、FYF41-14、MM28-5進行益生特性的篩選。
表2體外模擬人體胃腸液存活率
2.3雙歧桿菌菌株益生特性試驗
2.3.1表面疏水性
圖4結果表明，菌株FYF41-14疏水率最高，為35.35%，菌株MM28-5疏水率為23.50%，菌株FYF23-17疏水率為25.10%，菌株FYF41-14疏水率顯著高于菌株MM28-5、FYF23-17（t=29.802、38.002，均P＜0.001）。
圖4菌株表面疏水率
2.3.2表面自聚集能力
結果如圖5所示，菌株MM28-5在24 h后自聚集率為50.80%，菌株FY41-14在24 h后自聚集率為49.28%，二者差異無統計學意義（t=2.521，P＞0.050），菌株FYF23-17自聚集率最低，為34.06%，顯著低于菌株MM28-5和FY41-14（t=20.882、42.215，均P＜0.050）。
圖5菌株表面自聚集能力
2.3.3抑菌能力
對菌株FYF23-17、MM28-5和FY41-14進行抑菌能力測定，結果見圖6所示，菌株FYF41-14抑制沙門菌能力顯著高于其他菌株（t=6.971、13.380，均P＜0.050），對于志賀菌的抑制能力顯著高于菌株MM28-5（t=3.738，P=0.020），3個菌株在抑制金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌能力之間差異無統計學意義。
圖6菌株抑菌試驗結果
2.4安全性評價
2.4.1抗生素耐藥性
結果如表3所示。菌株FYF41-14對丁胺卡那、慶大霉素、卡那霉素及新霉素不敏感，對其余種類抗生素具有一定的敏感性，表明其具有一定的安全性。
表3菌株抗生素耐藥性試驗結果
2.4.2溶血試驗
菌株FYF41-14生長72 h后無顯著變化，不存在溶血圈，認為其為γ?溶血，不具有溶血活性，對照菌株金黃色葡萄球菌有顯著透明抑菌圈，證明其為β?溶血。
2.4.3菌株FYF41-14全基因組信息
為了確定菌株FYF41-14的分類學地位，排除其為已知益生菌，對其基因組特征和系統發育進行分析，對其進行全基因組測序并組裝，結果顯示，該菌株全基因組序列大小為2.19 Mb，平均GC含量為60.21%，整個基因組共注釋到1 918個蛋白編碼基因（CDS），3個rRNA基因和57個tRNA基因。進一步從基因組角度探究該菌株的安全性，將菌株蛋白序列與CARD數據庫進行比對，結果顯示該菌株檢出2種抗性基因，分別為莫匹羅星抗性基因Bbif_ileS_MUP和利福平抗性基因rpoB2，二者均為雙歧桿菌特有的抗生素抗性基因。將菌株蛋白序列與VFDB數據庫進行比對，結果顯示該菌株未檢索到毒力因子，推測該菌株不存在致病基因，提示菌株FYF41-14具有一定的安全性。菌株FYF41-14序列與長雙歧桿菌長亞種模式株及部分優良菌株序列的系統發育關系分析結果見圖7，菌株FYF41-14與長雙歧桿菌長亞種聚為一個分支，表明FYF41-14為長雙歧桿菌長亞種。
圖7長雙歧桿菌FYF41-14系統發育樹
3.討論
雙歧桿菌作為人體腸道菌群的重要組成部分，具有改善腸道菌群、增強免疫力、抑制有害菌的生長等多種益生功能，從而維護腸道菌群平衡與健康。大量體外和臨床研究表明攝入特定雙歧桿菌菌株對宿主健康可產生有益影響，目前，我國具有自主知識產權的優良特性雙歧桿菌菌株數量較少，因而分離保藏雙歧桿菌菌株，并從中篩選優良特性的雙歧桿菌對豐富我國雙歧桿菌菌種資源有著重要意義。
本研究招募健康人群，從其糞便樣本中分離鑒定雙歧桿菌，通過耐受性試驗、益生特性試驗篩選具有益生特性的雙歧桿菌，并驗證其安全性。通過構建系統發育樹可以發現，各分支聚類同源相似性均大于95%，其中，Bifidobacterium longum subsp.suis ATCC 27533（M58743）和Bifidobacterium longum subsp.iuvenis NCC 5000（OP696622）兩亞種聚到一起，這是由于Bifidobacterium longum subsp.iuvenis是從Bifidobacterium longum subsp.suis中新劃分出的亞種，親緣關系較為接近。
本研究選擇較為常見的營養豐富或可用于厭氧菌株分離的8種培養基，當前分離篩選具有特定益生功能的菌株是獲得潛在益生菌的重要方法，有研究發現在分離菌株時設定適宜的培養條件，更易獲得目標菌株。由于雙歧桿菌分離較為困難，本研究通過對不同培養基雙歧桿菌分離率進行比較，發現分離雙歧桿菌適宜培養基為MRSC，其分離種類最豐富，數量最多，這是因為MRSC中添加了還原劑L?半胱氨酸鹽酸鹽，其在維持低氧化還原電位的同時，還可以補充半胱氨酸以促進雙歧桿菌生長。LA、LF培養基未分離得到雙歧桿菌，可能是由于其組成成分無法使雙歧桿菌正常生長。鐘智等的研究發現不同短雙歧桿菌菌株對部分抗生素敏感程度存在差異，且對萬古霉素、慶大霉素等抗生素具有一定的耐藥性。馬昕瑋等對48株假小鏈雙歧桿菌耐藥性的研究發現其對上述2種抗生素也具有一定耐受能力。有研究表明青春雙歧桿菌對鏈霉素有耐藥性。雙歧桿菌可產生胞外多糖以獲得對部分抗生素的耐藥性，如增加其胞外多糖產量可增強β-內酰胺類抗生素耐藥性，但也有研究發現除個別種類抗生素外，不同種雙歧桿菌對抗生素的敏感程度存在株間差異。綜合來看，LA、LF培養基不適用于糞便樣本中雙歧桿菌的分離，通過使用抗生素對分離特定種屬雙歧桿菌菌株的目標仍需進一步研究。有研究表明，長雙歧桿菌為人體腸道內的優勢菌株，在各年齡段人群腸道環境中普遍存在，青春雙歧桿菌與假小鏈雙歧桿菌被認為是成人型雙歧桿菌，多在成人樣本中分離得到，本實驗中也得到相似結果，這表明不同種雙歧桿菌由于其種屬特性可能更適宜在特定人群樣本中分離得到。短雙歧桿菌在除LA、LF以外的6種培養基中分離得到，這表明短雙歧桿菌相比其他種雙歧桿菌可能具有更廣泛的營養物質利用能力，不同種雙歧桿菌因其種間特異性對不同營養物質的利用偏好也不盡相同，如兩歧雙歧桿菌由于其對母乳低聚寡糖的專性代謝特性更宜在嬰幼兒腸道環境中分離。
人體胃腸液構成了一個從極度酸性到堿性的連續極端環境，胃酸、胃蛋白酶、胰蛋白酶等都可能在消化過程中導致菌體細胞的死亡。這對攝入益生菌的生存與功效形成了嚴峻挑戰，因此本團隊以益生菌Bifidobacterium animalis subsp.lactis V9作為對照，從239株雙歧桿菌中篩選在pH 3.0、膽鹽濃度0.3%條件下耐受性較好的菌株，并通過人工胃腸液試驗，篩選得到3株存活率較高的長雙歧桿菌，耐受性試驗表明菌株FYF41-14具有良好耐酸性，可能具有某些益生功能，而耐酸能力較好的菌株可更好發揮其益生作用。有研究認為，菌株發揮其益生功能受黏附能力影響，通過測定疏水性與自聚集能力判斷菌株是否具有較高的黏附能力，菌株表面疏水性與其腸道黏附能力呈現正相關，疏水性越高，其黏附能力越強，而自聚集是指當細菌在環境中處于某種特定條件時，其內部會發生的一種聚集現象。菌株自聚集率越高，表明其黏附能力越強。有研究認為二者可相互影響，且多數呈現正相關趨勢。本實驗中菌株FYF41-14具有良好的疏水性（35.35%）和自聚集能力（49.28%），表明其具有較高的腸道黏附潛力，從而可以在腸道環境內通過競爭黏附位點、生成短鏈脂肪酸等多種方式抑制潛在致病菌的生長，并起到調節菌群構成、維持腸道菌群穩態的作用。益生菌應具有安全性，本實驗結果表明菌株FYF41-14可對多數抗生素類藥物敏感，未攜帶有致病基因，且不具有溶血活性。將菌株FYF41-14序列與部分優良菌株序列進行系統發育關系分析，發現菌株FYF41-14與長雙歧桿菌長亞種聚為一個分支，表明FYF41-14為長雙歧桿菌長亞種。同時，其與模式株和優良菌株位列不同的分支，綜合前期實驗表明該菌株為未被深入探索且具有潛在益生特性的雙歧桿菌。
綜上所述，從健康人群糞便樣本中分離鑒定雙歧桿菌，通過耐受性試驗、益生特性試驗及安全性驗證，最終篩得1株具有良好益生特性的長雙歧桿菌長亞種FYF41-14，可為人源益生菌的開發利用提供候選菌株。
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