基于生長速率法優化放線菌發酵培養基和發酵條件（一）
摘要
柑橘是我國優勢水果產業，對推動鄉村振興具有重要意義。但柑橘表面存在許多自然孔口，在采后貯藏和運輸過程中極易受到病原菌的侵染而發生病害。其中，柑橘綠霉病是由指狀青霉（Penicillium digitatum）侵染而成，發病過程快，傳染性強，造成果實采收后品質嚴重下降，給柑橘產業帶來巨大的經濟損失。本團隊以柑橘綠霉病病原菌為靶標菌，從廣東省湛江市廉江九洲江紅橙園紅橙植株的根部土壤中分離篩選出1株對柑橘綠霉病病原菌具有良好拮抗作用的放線菌R2A-77，對菌株進行形態學觀察、生理生化特征和分子生物學鑒定，采用生長速率法對靶標菌生長圈直徑判斷發酵液的抑菌活性，采用單因素和交叉組合試驗優化菌株發酵條件，以提高發酵液抑菌活性。
結果表明：放線菌R2A-77初步鑒定為鏈霉菌屬（Streptomyces）；最優發酵培養基為蔗糖10 g/L、大豆蛋白胨35 g/L、蒸餾水1000 mL；最優發酵條件為發酵初始pH 7.0、發酵時間為6 d、接種量為3%、裝液量為150 mL/250 mL；放線菌R2A-77發酵條件優化后，其發酵液的抑菌活性比優化前提高15%，抑菌率為98%。結果說明，放線菌R2A-77對指狀青霉具有較好的拮抗效果，有較好的實際應用前景，該研究結果為綠色防控柑橘綠霉病積累了資源，為后期規模化發酵以及生防菌劑的開發奠定基礎。
放線菌是一類極具開發潛力的生物資源，在空氣、土壤以及水體中均可生存，且具有生長速度快和代謝產物多等特點，已被廣泛應用于食品、藥品和農業等領域。目前，利用生防放線菌與病原菌的競爭關系或拮抗作用來控制病害已成為研究熱點。已有研究表明，放線菌發酵液對辣椒白絹病菌（Sclerotium rolfsii）、山茶炭疽病菌（Colletotrichum camelliae）、禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum）等植物病原菌具有良好的抑菌活性。在公眾對食品安全關注度持續攀升的當下，利用生物手段防治農作物病害，已成為農業微生物領域的關鍵研究課題。
指狀青霉（Penicillium digitatum）是一種壞死營養型的病原真菌，可通過果實表面的損傷入侵果實內部組織，導致宿主細胞死亡，進而利用營養進行生長。柑橘在田間生長、采收及貯藏運輸過程中極易受到物理損傷而產生傷口，這為病原微生物的入侵創造了條件，最終導致果實腐爛，造成嚴重的經濟損失。長期以來，國內外對水果病害的防治主要依賴化學殺菌劑，但長期使用化學殺菌劑不僅會導致病原菌產生耐藥性而降低防治效果，還會嚴重危害人體健康和環境。而生物防治法采用具有安全性、有效性、環保性和高經濟效益優勢的拮抗微生物，可實現農業的安全生產。NAJMEH等從農田土壤中分離出的110株鏈霉菌菌株對指狀青霉具有良好的抑制作用。林書華等揭示了鏈霉菌X33發酵提取物（SLFE）對柑橘綠霉病菌具有防治效果。本團隊從廣東省湛江市廉江九洲江紅橙園紅橙植株根部土壤中分離篩選出1株對指狀青霉具有較好拮抗活性的放線菌R2A-77，本研究對該菌株進行鑒定以及發酵條件優化，為廉江紅橙土壤微生物資源及活性物質的開發奠定基礎。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1供試菌株和病原真菌
從廣東省湛江市廉江九洲江紅橙園紅橙植株根部土壤分離篩選出放線菌R2A-77。指狀青霉由西南大學食品科學學院曾凱芳教授惠贈。
1.1.2培養基
菌株鑒定固體培養基：ISP系列培養基（ISP1~ISP7）、PDA培養基、R2A培養基、GA培養基、改良G2培養基、MS培養基、NA培養基、黑色素培養基、硫化氫培養基、明膠液化培養基、牛奶凝固與胨化培養基。
菌株液體發酵培養基：ISP系列培養基（ISP1~ISP7）、PDA培養基、GA培養基、改良G2培養基、MS培養基。
生長培養基：改良G2培養基。
1.2方法
1.2.1菌株鑒定
（1）形態學觀察。將菌株劃線接種至ISP3固體培養基，28℃條件培養5 d，用掃描電鏡觀察菌絲特征及孢子形態。
采用固體培養基劃線接種菌株，在28℃下培養10 d。在第3、5、7、10天采用平皿插片法和光學顯微鏡觀察菌株菌體形態，篩選出菌株最優生長培養基作為基礎培養基。
（2）生理生化特征測定。參考文獻中的方法對菌株的生理生化特性進行測定。測定內容包括：最適溫度、最適鹽濃度、最適培育pH、過氧化氫酶的產生、黑色素/硫化氫的產生、明膠液化、牛奶凝固或胨化。
（3）16S rRNA基因序列測定與分析。將菌株送至北京擎科生物科技有限公司進行16S rRNA基因序列測定。測序結果與EzBioCloud數據庫進行比對，篩選相似菌株。采用MEGA 11軟件進行鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）系統發育分析，設置1000次bootstrap評估拓撲結構，構建16S rRNA基因的系統發育樹，確定菌株的種屬。
1.2.2菌株抑菌能力測定
（1）菌種活化和制備種子液。菌種活化：將菌種接種至改良G2固體培養基中，于28℃培養5 d。
制備種子液：將菌株接種至150 mL/250 mL的改良G2液體培養基中，于28℃、180 r/min搖床培養3 d。
（2）制備菌株無菌發酵液。將3%的種子液加入到150 mL/250 mL發酵培養基中，于28℃、180 r/min培養5 d。取發酵上清液，于10 000 r/min離心15 min，用0.22μm微孔濾膜過濾后得到無菌發酵濾液。
（3）發酵液抑菌活性測定。采用生長速率法測定菌株發酵液對靶標菌的抑菌活性。發酵液與PDA培養基按1∶10（V/V）制成平板。將8 mm靶標菌菌餅置于平板中央，于28℃培養5 d后，采用十字交叉法測量菌落直徑，計算平均值和抑菌率。抑菌率=[(對照病原菌菌落直徑-處理病原菌菌落直徑)/(對照病原菌菌落直徑-菌餅直徑)]×100%。
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