DAPI熒光染色計(jì)數(shù)法：不同保藏方式時(shí)間對(duì)海洋微型底棲生物計(jì)數(shù)結(jié)果的影響——摘要、材料與方法
DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindole,4′,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚)是一種靈敏度高、特異性強(qiáng)的熒光染料,對(duì)細(xì)胞核及染色體有很好的染色效果。它可與DNA的A-T堿基結(jié)合形成DAPI-DNA復(fù)合物,該復(fù)合物在紫外激發(fā)光(365nm)下會(huì)發(fā)出藍(lán)色熒光。而福爾馬林固定的樣品經(jīng)DAPI染色時(shí),甲醛可誘發(fā)蛋白質(zhì)中的芳香乙胺基團(tuán)轉(zhuǎn)化為熒光色團(tuán),從而使細(xì)胞質(zhì)熒光較強(qiáng),由此可見整個(gè)細(xì)胞的輪廓。此外,細(xì)胞內(nèi)的色素體在綠色激發(fā)光下發(fā)出紅色熒光,可計(jì)數(shù)自養(yǎng)鞭毛蟲。由此,DAPI不僅用于細(xì)菌計(jì)數(shù),也可用于藍(lán)細(xì)菌、硅藻、自養(yǎng)和異養(yǎng)小鞭毛蟲及纖毛蟲等微型底棲生物計(jì)數(shù)。結(jié)合復(fù)染劑Evans Blue的使用,可使染色后的細(xì)胞更容易辨認(rèn)。
樣品的保藏方式及保存時(shí)間是影響DAPI熒光計(jì)數(shù)效能的重要因素。對(duì)海洋浮游細(xì)菌及鞭毛蟲的研究發(fā)現(xiàn),固定后的樣品隨著保藏時(shí)間延長(zhǎng),可造成數(shù)量低估。Daley等、Sherr等及Kepner等發(fā)現(xiàn)經(jīng)福爾馬林固定的浮游樣品于5℃下避光保存1～3周后,對(duì)細(xì)菌的計(jì)數(shù)結(jié)果無(wú)差異。Porter等報(bào)道福爾馬林固定的浮游樣品經(jīng)DAPI染色后封片,4℃下保存24周對(duì)細(xì)菌的計(jì)數(shù)結(jié)果無(wú)差異。但Hyun等報(bào)道經(jīng)福爾馬林固定后的浮游樣品,貯藏于樣品瓶的計(jì)數(shù)結(jié)果優(yōu)于封片保存的。Turley等用戊二醛固定浮游樣品并經(jīng)常溫避光保藏,40天后發(fā)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌的計(jì)數(shù)數(shù)量平均減少了39%,而經(jīng)DAPI染色封片并冷凍保存70 d的細(xì)菌計(jì)數(shù)則無(wú)影響。而Pomroy發(fā)現(xiàn)經(jīng)過Lugol’s液固定的浮游樣品在室溫避光保存4年未造成對(duì)細(xì)菌數(shù)量的低估,對(duì)鞭毛蟲可保存10年甚至更長(zhǎng)而無(wú)數(shù)量變化。但是,上述研究均源自浮游樣品,對(duì)于底棲樣品則缺少系統(tǒng)的研究。僅Hamels等報(bào)道沉積物中的鞭毛蟲經(jīng)DAPI染色封片后可冷凍避光保存1個(gè)月,而經(jīng)Percoll液提取后的鞭毛蟲經(jīng)同樣處理可保存2個(gè)月。
由于細(xì)菌及原生生物因可附著于其他生物體和/或沉積物顆粒表面(如“海雪”),若不加處理直接以DAPI進(jìn)行熒光計(jì)數(shù),可對(duì)其數(shù)量乃重要性造成不同程度的低估。目前最為有效的做法是首先利用超聲波等設(shè)備將底棲生物與沉積物分散開,然后再行染色計(jì)數(shù)。但在野外尤其是海上取樣時(shí),因取樣站位多、時(shí)間緊、超聲波分散儀及離心設(shè)備等現(xiàn)場(chǎng)無(wú)法使用,將樣品進(jìn)行保藏(冷凍或冷藏)后帶回室內(nèi)分析是較為可行的方法。保藏方式對(duì)于無(wú)細(xì)胞壁的原生生物尤為重要,如在冷凍保藏的凍融過程中,可因細(xì)胞膜的破裂而無(wú)法準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。此外,出海采集常涉及大量樣品,樣品分析完成常需數(shù)周甚至數(shù)月。因此,測(cè)試不同保藏方式和保存時(shí)間對(duì)沉積物樣品定量分析的影響,是對(duì)數(shù)量進(jìn)行準(zhǔn)確估算的重要環(huán)節(jié)。
作者采用DAPI熒光染色計(jì)數(shù)法對(duì)海洋沉積物樣品中的細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌、自養(yǎng)小鞭毛蟲(PNF)和異養(yǎng)小鞭毛蟲(HNF)及硅藻進(jìn)行了冷藏與冷凍兩種保藏方式的比較分析,同時(shí)比較研究了不同保藏時(shí)間(1個(gè)月和4個(gè)月)對(duì)這些微型底棲生物計(jì)數(shù)結(jié)果的影響。
1材料與方法
1.1研究站位和樣品采集
用內(nèi)徑1.6 cm的采樣管(注射器改造),從未受擾動(dòng)的0.1 m2改進(jìn)型Gray-Ohara箱式采泥器中,隨機(jī)采集5 cm長(zhǎng)芯樣4個(gè),每個(gè)芯樣按0～2 cm、2～5 cm分層移入50 mL離心管中,加入經(jīng)濾膜(孔徑0.22μm)過濾的海水配制的2.5%甲醛溶液分別至20 mL和30 mL進(jìn)行固定。每個(gè)重復(fù)各取10 mL后合并共計(jì)40 mL,一份于4℃避光冷藏保存,一份放置在冰柜-20℃避光冷凍保存。
冷凍和冷藏對(duì)比實(shí)驗(yàn)選取2007年7月采集自黃海的編號(hào)為3205(32°N,124.5°E)、3403(33.5°N,123°E)、4018(33°N,122.5°E)三個(gè)站位的0～2 cm分層樣品;保存時(shí)間實(shí)驗(yàn)選取2008年開放共享航次編號(hào)為3400-8(34°N,124°E)、3800-1(38°N,121.7°E)兩個(gè)站位的0～2 cm、2～5 cm分層的樣品(圖1)。沉積物粒度分析采用Cilas(940L)型激光粒度儀進(jìn)行測(cè)定。其他環(huán)境資料來(lái)自溫鹽深測(cè)定儀(CTD)現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定。
圖1黃海采樣站位
1.2樣品分析方法
取適量樣品(約2mL)加入焦磷酸四鈉(f.c.1 mmol/L),常溫避光培育15～30 min。經(jīng)JY92-II超聲波分散處理180 s(振幅109μm,50 W,6 mm Microtip),為避免樣品過熱,每超聲破碎處理45 s,冷卻1 min。取分樣后,根據(jù)鏡檢樣品中生物的密度,調(diào)節(jié)至適當(dāng)?shù)南♂尡堵?細(xì)菌以每個(gè)視野20～30個(gè)為宜,鞭毛蟲以沉積物不遮擋生物為宜),加入DAPI(f.c.5 mg/L)和復(fù)染劑Evans Blue(f.c.10-6g/mL),低溫避光染色10 min。染色樣品經(jīng)Sartorius真空過濾系統(tǒng)濃縮過濾到黑混合纖維素膜上。封片后置于Zeiss Axioskop 2 plus HBO 100熒光顯微鏡油鏡下鏡檢計(jì)數(shù)。細(xì)菌的計(jì)數(shù)在紫外光激發(fā)(BP 365/12,FT 395,LP 397)下,每片隨機(jī)計(jì)數(shù)20～40個(gè)視野,總計(jì)500個(gè)左右。鞭毛蟲的計(jì)數(shù)根據(jù)其最長(zhǎng)粒徑劃分為2～5μm,5～10μm,＞10μm三個(gè)粒級(jí),先在紫外激發(fā)光下每片隨機(jī)計(jì)數(shù)50個(gè)視野(此為鞭毛蟲總數(shù)),后轉(zhuǎn)換至綠色激發(fā)光(BP 546/12,FT 580,LP 59)下,每片快速隨機(jī)計(jì)數(shù)50個(gè)視野(為自養(yǎng)小鞭毛蟲(PNF)總數(shù))。異養(yǎng)小鞭毛蟲(HNF)的數(shù)目為鞭毛蟲總數(shù)與自養(yǎng)小鞭毛蟲數(shù)目的差值。根據(jù)視野面積以及樣品稀釋倍率換算各生物類群的最終豐度。微型底棲生物豐度的計(jì)算按如下公式：
A=(N/Sf)SD/V
其中,A為豐度(個(gè)/mL);N為各視野平均數(shù)(個(gè));Sf為1000×下顯微鏡視野面積(cm2);S為濾膜實(shí)際過濾面積(cm2);D為稀釋倍數(shù);V為染色用的樣品體積(mL)。
文中采用如下縮寫：自養(yǎng)小鞭毛蟲PNF(2～5μm)、PNF(5～10μm)、PNF(＞10μm);異養(yǎng)小鞭毛蟲HNF(2～5μm)、HNF(5～10μm)、HNF(＞10μm)。
1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析
采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,將沉積物中各類群豐度的不同處理進(jìn)行T-test檢驗(yàn)。為使數(shù)據(jù)正態(tài)分布,將原始數(shù)據(jù)經(jīng)過log轉(zhuǎn)化處理。
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