不同濃度巴西蘇木素對耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌生長及抑制作用（二）
1.2.2蘇木抑菌試驗
1.2.2.1蘇木萃取液、巴西蘇木素和原蘇木素B溶液制備
稱量蘇木100 g放于離心管中與無水乙醇200 mL以1∶2的比例混勻，于恒溫培養振蕩器中震蕩48 h然后離心，4 500 r/min離心5 min，取離心管稱量并標記序號，取上清液于離心管中，開蓋放入恒溫培養振蕩器中50℃震蕩24～96 h以揮發盡無水乙醇，稱取萃取后蘇木質量，加適量DMSO配成1 000 mg/mL的萃取液原液，再取原液倍比稀釋成500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.63、7.81、3.90 mg/mL共8個質量濃度。將巴西蘇木素單體和原蘇木素B單體分別用DMSO配制成64.000 0、32.000 0、16.000 0、8.000 0、4.000 0、2.000 0、1.000 0、0.500 0、0.250 0、0.012 5、0.063 0 mg/mL共11個質量濃度。
1.2.2.2菌液制備
將所有CRABA接種于血平板，37℃培養18 h，挑取數個分離純化后的菌落置于生理鹽水試管中,比濁儀校正濃度至0.5麥氏單位(1.5×108cfu/mL)。
1.2.2.3蘇木萃取液對10株CRABA的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)和最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration，MBC)測定
于無菌96孔板中每孔加入肉湯菌液100μL，第1個孔加入1 000 mg/mL蘇木萃取液100μL，采用微量倍比稀釋法，使蘇木萃取液質量終濃度分別為500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.63、7.81和3.90 mg/mL共8個濃度，每孔加入菌液20μL。將96孔板放于37℃培養箱培養18 h。
1.2.2.4巴西蘇木素對10株CRABA的MIC、MBC測定
于無菌96孔板中每孔加入肉湯100μL，而后加入11個濃度分別為64.000 0、32.000 0、16.000 0、8.000 0、4.000 0、2.000 0、1.000 0、0.500 0、0.250 0、0.012 5、0.063 0 mg/mL的巴西蘇木素溶液100μL，每孔加入菌液20μL，取菌液200μL作為陽性對照，肉湯培養基200μL作為陰性對照。將96孔板放于37℃培養箱培養18 h。
1.2.2.5原蘇木素B對10株CRABA的MIC測定
于無菌96孔板中每孔加入肉湯100μL，而后加入11個濃度分別為64.000 0、32.000 0、16.000 0、8.000 0、4.000 0、2.000 0、1.000 0、0.500 0、0.250 0、0.012 5、0.063 0 mg/mL的原蘇木素B溶液100μL，每孔加入菌液20μL，取菌液200μL作為陽性對照，肉湯培養基200μL作為陰性對照。將96孔板放37℃培養箱培養18 h。
1.2.3高效液相檢測蘇木組分
1.2.3.1樣品提取
稱取蘇木各5 g置于錐形瓶中，加入乙醇100 mL，用封口膜把瓶口封好。超聲提取30 min，用0.22μm有機膜濾膜過濾到樣品瓶中。
1.2.3.2標準品溶液的制備
分別精密稱取蘇木提取液、巴西蘇木素、DMSO，置于3個滅菌EP管中。
1.2.3.3高效液相色譜法檢測
采用C18(5μm，4.6 mm×250.0 mm)色譜柱，流速為1.0 mL/min，檢測波長210 nm，柱溫35℃，進樣量5μL。流動相為乙腈∶水，梯度洗脫條件見表1。
表1梯度洗脫條件
1.2.4CRABA的生長曲線測定
取培養至對數生長期的CRABA，用無菌生理鹽水配制成0.5麥氏濁度，取100μL菌液分別加至巴西蘇木素濃度不同的100μL肉湯培養基中，使肉湯中巴西蘇木素的濃度為1/8 MIC(0.063 0 mg/mL)、1/2 MIC(0.250 0 mg/mL)、1 MIC(0.500 0 mg/mL)。每隔4 h進行取樣，用酶標儀檢測600 nm處的吸光度值，繪制生長曲線。
1.2.5十二烷基磺酸鈉(sodium 1-dodecanesulfonate,SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)
取培養至對數生長期的CRABA，配制成0.5麥氏濁度，取3 mL菌液分別加至巴西蘇木素濃度不同的3 mL肉湯培養基中，使巴西蘇木素的濃度為1/8 MIC(0.063 0 mg/mL)、1/2 MIC(0.250 0 mg/mL)、1 MIC(0.500 0 mg/mL)。置于37℃、200 r/min搖床培養，于16 h取樣4 mL，3 155×g離心10 min，去除上清液，收集菌體；加入4 mL磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)并萃取，洗滌1次(3 155×g離心10 min)，再加入2 mL PBS，取等體積(1 mL)的各標本加入EP管，5 560×g離心5 min(23℃)收集菌體，重懸于160μL PBS并加40μL蛋白上樣緩沖液混勻，沸水浴10 min轉速300 r/min后13 350×g離心10 min，取上清液備用。選用12%分離膠，5%濃縮膠，上樣20μL進行SDS-PAGE。經考馬斯亮藍染色1 h后脫色，顯示蛋白譜帶。
1.2.6巴西蘇木素與美羅培南聯合抑菌試驗
配制0.500 0、0.250 0、0.063 0、0.031 0 mg/mL的巴西蘇木素和0.256 0、0.128 0、0.064 0、0.032 0、0.016 0 mg/mL的美羅培南，將不同濃度的巴西蘇木素和美羅培南交叉配制為200μL肉湯后加入96孔板，并將板置于Biosense全自動微生物生長曲線分析系統上。配制不同濃度的巴西蘇木素+美羅培南肉湯各200μL加入96孔板，加入配制試驗菌液20μL，37℃培養24 h，觀察結果。記錄MIC甲藥單用和MIC乙藥單用，并觀察兩藥聯用的MIC甲藥聯用和MIC乙藥聯用，相加值最小數值為最佳組合，計算部分抑菌濃度(fractional inhibitory concentration，FIC)指數。FIC指數≤0.5為協同作用，>0.5～1.0為相加作用，>1.0～2.0為無關作用，>2.0為拮抗作用。
不同濃度巴西蘇木素對耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌生長及抑制作用（一）
不同濃度巴西蘇木素對耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌生長及抑制作用（二）
不同濃度巴西蘇木素對耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌生長及抑制作用（三）
相關新聞推薦
1、適用于低鹽發酵香腸葡萄球菌與乳酸菌生長特性及產酸能力測定及篩選（一）