家兔肺支氣管敗血波氏桿菌生長曲線測定及耐藥性研究（一）
摘 要:為深入了解兔支氣管敗血波氏桿菌(Bordetella bronchiseptica, Bb),試驗將病兔體內分離得到的菌株進行菌株鑒定、生長曲線測定、致病性研究、藥敏試驗及耐藥基因檢測,期望了解該菌的生長規律,為臨床用藥及防控奠定基礎。通過 Gram 染色鏡檢、分離培養、16S rDNA 序列分析對分離菌株進行鑒定,測定了該分離株的生長曲線、半數致死量、耐藥性并對分離菌株進行 β-內酰胺酶耐藥基因的檢測。結果表明:分離得到 1 株革蘭氏陰性桿菌,命名為 P201215,該分離株的 16S rDNA 基因序列與 GenBank 中支氣管敗血波氏桿菌(登錄號為 NR113628.1)的同源性為 99%。分離株的對數生長期為 2~9 h,9 h 后進入平臺期;對 KM 小鼠的半數致死量為 1.19×107 CFU。藥敏試驗結果顯示,分離株對部分頭孢菌素類藥物耐藥,對大部分 β-內酰胺類、喹諾酮類、四環素類及氨基糖苷類藥物敏感,PCR 檢測未檢出超廣譜 β-內酰胺酶耐藥基因。
支氣管敗血波氏桿菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)是革蘭陰性小桿菌,大小為 0.2~0.5 μm×0.5~2.0 μm,無芽孢。本菌能夠感染多種哺乳動物,如豬、家兔、馬、犬等,主要引起豬萎縮性鼻炎和兔波氏桿菌病。支氣管敗血波氏桿菌感染兔后能導致病兔體溫升高、咳嗽、流鼻涕及突然死亡,出現支氣管肺炎及肺膿腫等病理變化。在養殖行業中,該菌常與兔巴氏桿菌、葡萄球菌等混合感染,無癥狀攜帶或有臨床癥狀均會給養殖者造成巨大的經濟損失,而家兔是伴侶動物,兔波氏桿菌病也意味著人畜共患的風險。
目前該病的治療措施以抗生素治療為主,但由于目前 β-內酰胺類抗生素是臨床上使用最廣泛的抗生素,許多病原體對 β-內酰胺酶類抗生素已產生嚴重的耐藥性,其中革蘭氏陰性桿菌對該類藥物的耐藥率持續上升。多篇研究指出,支氣管敗血波氏桿菌對青霉素類和頭孢菌素類藥物存在較高的耐藥性,其機制為細菌產生 β-內酰胺酶水解藥物中的 β-內酰胺環從而使藥物失活。超廣譜 β-內酰胺酶(extended spectrum β-lactamerses,ESBLs)能夠水解 β-內酰胺酶,主要由腸桿菌科細菌產生,ESBLs 基因在質粒介導下,可通過接合、轉化和轉導等多種形式在細菌間擴散,是細菌對 β-內酰胺類抗生素產生耐藥性的主因。因此,檢測分離株的耐藥性及 ESBLs耐藥基因對指導臨床用藥有重要意義。
試驗所用菌株是從死亡家兔肺組織病料中分離得到,經測序鑒定為支氣管敗血波氏桿菌,試驗對其進行生長曲線測定,以了解其生長規律。同時用分離株測定其對 SPF 級 KM 小鼠的半數致死量,并進行了耐藥性和 β-內酰胺酶基因檢測,以期為后續對本菌的深入研究奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 材料
病料與試驗動物:病死家兔收集于某兔業合作社。SPF 級 KM 小鼠,18~22 g,36 只,雌雄各半,購自成都達碩實驗動物公司。
主要試劑和儀器:LB液體培養基、含5%血清的TSB瓊脂培養基、MH培養基、1 mL注射器、胎牛血清等;抗菌藥敏紙片,購自杭州微生物試劑有限公司;DNA 分子量標,購自北京擎科生物科技有限公司;細菌基因組 DNA 提取試劑盒,購自天根生化(北京)有限公司;PCR 擴增儀、核酸電泳儀等,購自美國百樂公司;紫外線分光光度計、臺式冷凍離心機,購自賽默飛世爾科技公司。
1.2 方法
1.2.1 細菌的分離純化、16S rDNA 基因擴增及序列分析
無菌采集病死動物肺組織,連續劃線接種于含 5% 血清的 TSB 培養基上,37 ℃培養 24 h,挑取單個菌落進行革蘭氏染色鏡檢,觀察菌落形態及細菌大小形態。將單個菌落純化后加入甘油與生理鹽水 1∶1 體積比混勻液中,保存于-80 ℃。
用細菌基因組 DNA 提取試劑盒提取分離株 DNA 進行 PCR 擴增,引物序列見表 1。反應體系(20 μL):2× Taq PCR Master 10 μL,上下游引物各 1 μL,DNA 模板 1 μL,dd H2O 補足反應體系至 20 μL。反應程序:98 ℃預變性 3 min;98 ℃變性 15 s,58 ℃退火 15 s,72 ℃延伸 25 s,進行 35 個循環;72 ℃額外延伸 5 min。擴增后的產物經 1% 瓊脂凝膠電泳檢測后送北京擎科生物科技有限公司測序。測序結果經 BLAST 比對后,篩選 14 株 GenBank 上公布的相關細菌的 16S rDNA 進行同源性分析。利用 MEGA 7.0 軟件中的鄰接法(Neighbor-joining)構建進化樹。
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